用于快速緩沖液置換的滲濾
緩沖液置換是大多數(shù)大分子純化工作流程中一種簡單而重要的技術(shù)。它可用于去除不需要的物質(zhì)、調(diào)整樣品條件或?qū)⒔M分引入樣品中。
例如，在離子交換或親和層析中實(shí)現(xiàn)大分子的高效捕獲是在特定的緩沖條件下實(shí)現(xiàn)的。因此，通常建議在層析前將樣品更換為最適合的上樣緩沖液。
專業(yè)提示： 從澄清的細(xì)胞培養(yǎng)物中純化 His 標(biāo)記的蛋白質(zhì)吧！一些培養(yǎng)基配方包括螯合劑，會從親和層析基質(zhì)中剝離金屬離子。在將樣品上樣到 Sartobind? Lab IDA 之前，進(jìn)行緩沖液置換能有效去除這些不需要的物質(zhì)！
緩沖液置換的常見應(yīng)用
有三種常用的緩沖液置換方法：透析、凝膠過濾和超濾（表 1）。賽多利斯的緩沖液置換解決方案使用超濾作為首選方法，因?yàn)槠渚哂徐`活、快速和緩沖液消耗量低的特點(diǎn)。
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| ? | 透析 | 凝膠過濾 | 超濾 |
|---|---|---|---|
| 設(shè)備要求 | 低 | 高 | 低-中 |
| 消耗品 | 一次性使用 | 一次性使用或可重復(fù)使用 | 一次性使用或可重復(fù)使用 |
| 樣品通量 | 低 | 低 | 高 |
| 處理速度 | 慢 | 快 | 快 |
| 緩沖液消耗 | 高 | 低-中 | 低 |
表 1：緩沖液置換方法的比較。
- 去除鹽和洗滌劑
- 離子強(qiáng)度和 pH 值的調(diào)整
- 去除低分子量污染物
- 引入輔因子或抑制劑
- 添加防腐劑
緩沖液置換方法
透析
在這種方法中，將樣品放入透析管或包含半透膜的透析容器中。它被交換緩沖液（透析液）包圍。由于樣品和透析液之間的濃度梯度，緩沖液成分和其他低分子量溶質(zhì)通過擴(kuò)散穿過膜（圖 1）。
由于透析只需要使用磁力攪拌器和低成本耗材，因此這是一種經(jīng)濟(jì)的技術(shù)。然而，以擴(kuò)散為驅(qū)動力，這個過程需要很多小時甚至幾天才能完成。樣品容量通常在 0.1–100 mL 范圍內(nèi)，因此該方法僅適用于研究應(yīng)用。此外，一次性耗材和大量緩沖液消耗會導(dǎo)致大量浪費(fèi)。在某些情況下，最終樣品體積可能會增加，從而導(dǎo)致大分子稀釋并需要濃縮步驟。
圖 1：透析是一種經(jīng)濟(jì)但耗時的緩沖液置換方法。
凝膠過濾
該技術(shù)可在多孔樹脂色譜柱上通過尺寸排阻將大分子與原始緩沖液組分分離。樣品中的大分子快速通過色譜柱，而原始緩沖液和低分子量溶質(zhì)通過進(jìn)入樹脂珠的孔而減慢速度（圖 2）。
凝膠過濾柱有多種規(guī)格，可通過離心力、重力或在 FPLC 系統(tǒng)上進(jìn)行緩沖液更換。盡管處理方法范圍廣泛，設(shè)備成本可變，但依然可能非常高。處理時間也是變化的，盡管比透析快得多，尤其是使用離心或泵驅(qū)動的耗材時。在研究實(shí)驗(yàn)室中，這是樣品容量最有限的技術(shù)，體積范圍約為 0.1-10 mL。生物制藥生產(chǎn)的規(guī)模很有可能需要擴(kuò)大，但在這里，更大的體積會導(dǎo)致高空間、時間和緩沖液要求。
圖 2：凝膠過濾可實(shí)現(xiàn)更快的緩沖液更換，但對于體積較大樣品的容量有限。
滲濾
該過程涉及將大分子保留在過濾單元內(nèi)，而緩沖液和低分子量組分則通過半透膜。因此，通過截留物的逐漸稀釋和濃縮進(jìn)行緩沖液交換（圖 3）。
與凝膠過濾一樣，有多種設(shè)計(jì)的超濾裝置可供選擇，可在離心力、氣壓、溶劑吸收或切向流過濾 （TFF） 下實(shí)現(xiàn)快速滲濾。大多數(shù)研究實(shí)驗(yàn)室通常都有這些所需的設(shè)備（離心機(jī)、壓縮氣源或蠕動泵），容量為 0.1–500 mL 及以上，適用于最廣泛的工藝體積。
圖 3：使用超濾裝置，滲濾可實(shí)現(xiàn)幾乎任何樣品體積的快速高效緩沖液置換。
滲濾的優(yōu)勢：
- 高速 - 與傳統(tǒng)方法相比，可節(jié)省 >90% 的時間
- 更大處理量 — 單步緩沖液置換，樣品體積可高達(dá) 500 mL。
- 即插即用 - 易于使用的解決方案，對設(shè)備的要求最低。
- 減少浪費(fèi) — 由于交換量低，可將緩沖液消耗量減少 >98%。
專業(yè)提示：您的目標(biāo)分子是否達(dá)到您需要的濃度？大分子可以通過超濾膜保留，同時減少樣品體積。嘗試使用 Vivaspin? Turbo 或 Vivaflow? ，在緩沖液更換之前或之后快速增加大分子的濃度。
滲濾技術(shù)
非連續(xù)滲濾
這是一個迭代過程，包括去掉原始緩沖液，然后添加交換緩沖液（反之亦然）（視頻 1）。這些步驟重復(fù)多次，從而實(shí)現(xiàn)高度可控的緩沖液置換。這在評估分子穩(wěn)定性時特別有用，因?yàn)辂}濃度或 pH 值等因素可逐漸調(diào)整。
視頻 1：使用 Vivaspin? 進(jìn)行不連續(xù)滲濾。
連續(xù)滲濾
在這種技術(shù)中，以與去除原始緩沖液相同的速率將交換緩沖液添加到樣品中 （視頻 2）。這種單步過程可以提高緩沖液更換的速度和效率，但設(shè)置稍微復(fù)雜，并且需要特定配件。
視頻 2： 使用 Vivaspin? 20 滲濾杯進(jìn)行連續(xù)滲濾。
將超濾與滲濾相結(jié)合
超濾也是減少樣品體積和濃縮的有用工具。因此，超濾和滲濾都可以按順序進(jìn)行，通?？墒褂孟嗤某瑸V裝置。這樣做的好處是可以減少樣品操作和轉(zhuǎn)移步驟的數(shù)量，否則可能會降低目標(biāo)分子的回收率。UF/DF組合是雙贏的方式。
精選緩沖液置換資源
常見問題解答
要通過滲濾實(shí)現(xiàn) ≥99% 的緩沖液置換，請使用樣品體積的 3–5 倍的置換緩沖液。
為了進(jìn)行比較，在透析中，通常建議使用樣品體積 200–500 倍的交換緩沖液（或透析液）。此外，為了提高該方法的緩沖液置換效率，通常至少更換一次透析液。這會導(dǎo)致大量的緩沖液浪費(fèi)。
首先選擇更高效的緩沖液置換技術(shù)，例如滲濾。在開始滲濾（即所謂的超濾/洗濾 （UF/DF） 工藝）之前，選擇合適的超濾裝置來減少樣品體積，可以進(jìn)一步降低該方法中已經(jīng)很低的緩沖液消耗量。
使用 Vivaspin? 20 超濾管，最多可向超濾器中添加 2 mL 樣品。對于體積不超過 20 mL 的樣品，應(yīng)在滲濾前將其濃縮至 ≤2 mL。
對于較大的樣品量，TFF 可以提高工藝效率。Vivaflow? 滲濾儲液杯的容量為 500 mL。為了盡量減少緩沖液消耗，我們建議在進(jìn)行滲濾之前，將大于此體積（最多 5,000 mL）的樣品濃縮至 500 mL 或更小。
滲濾比透析等替代方法可節(jié)省 >90% 的時間。多樣化的超濾裝置設(shè)計(jì)可幫您利用實(shí)驗(yàn)室中已有的設(shè)備進(jìn)行滲濾，因此通常不需要對進(jìn)行額外的設(shè)備投資。
此外，與透析袋或凝膠過濾柱相比，超濾裝置的容量更高，這意味著可以對整個樣品進(jìn)行緩沖液更換，在大多數(shù)情況下，無需預(yù)濃縮或以多個較小的等分試樣處理樣品。
有時會發(fā)生膜污染或極化，導(dǎo)致處理時間增加（盡管仍然比透析快得多）。然而，Vivaspin? 和 Vivaflow? 等現(xiàn)代超濾裝置的堵塞和極化不太常見，因?yàn)樗鼈儾捎缅e流的技術(shù)和高度優(yōu)化的流路。
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