要有效分析基于 3D 支架的多腫瘤球可能頗具挑戰(zhàn)。傳統(tǒng)的酶標(biāo)儀分析缺少基于圖像的多方面分析，包括分析形態(tài)信息和確認(rèn)圖像中數(shù)據(jù)的功能。由于多種因素，傳統(tǒng)的成像系統(tǒng)本身就難以適應(yīng)體外培養(yǎng)模型的動(dòng)力學(xué)分析，主要原因如下：

• 數(shù)據(jù)不完整：成像間隔之間的信息缺失
• 多重不受控制的環(huán)境波動(dòng)： 細(xì)胞在培養(yǎng)箱和成像系統(tǒng)之間來(lái)回轉(zhuǎn)移，同時(shí)培養(yǎng)箱外冗長(zhǎng)的 3D 圖像采集方案會(huì)造成溫度差異，且無(wú)法控制氧氣和二氧化碳濃度
• 理想的圖像采集參數(shù)開(kāi)發(fā)非常耗時(shí)
• 圖像處理復(fù)雜，需要專家級(jí)操作人員生成定量信息

Incucyte^? 3D 多腫瘤球分析方案可提供集成式的完整解決方案，在組織培養(yǎng)箱內(nèi)實(shí)時(shí)自動(dòng)追蹤和定量腫瘤球的形成、生長(zhǎng)和健康狀態(tài)。

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• 生成可重現(xiàn)的定量數(shù)據(jù)：通過(guò)經(jīng)實(shí)驗(yàn)室測(cè)試的方案、高質(zhì)量圖像和客觀分析獲得適用于藥理學(xué)分析的可靠數(shù)據(jù)。
• 獲得更多生理相關(guān)信息：無(wú)標(biāo)記生長(zhǎng)定量和 Matrigel^? 層表面或嵌入其中的 3D 多腫瘤球模型培養(yǎng)物的形態(tài)學(xué)研究- 在培養(yǎng)箱中不受干擾得進(jìn)行。
• 揭示細(xì)胞隨時(shí)間的變化：使用無(wú)干擾型試劑進(jìn)行活力和毒性的實(shí)時(shí)多重測(cè)定，研究作用機(jī)制。
• 進(jìn)行生物學(xué)相關(guān)的共培養(yǎng)分析：結(jié)合額外的細(xì)胞類型，重現(xiàn)腫瘤微環(huán)境，并研究細(xì)胞隨時(shí)間的變化。

通過(guò)經(jīng)實(shí)驗(yàn)室測(cè)試的方案、高質(zhì)量圖像和客觀分析獲得適用于藥理學(xué)分析的可靠數(shù)據(jù)

圖 1. Incucyte^? 經(jīng)實(shí)驗(yàn)室測(cè)試的多腫瘤球模型方案可減少 3D 細(xì)胞培養(yǎng)中解決難題的時(shí)間，無(wú)需反復(fù)實(shí)驗(yàn)即可獲得適合定量分析的圖像。

無(wú)標(biāo)記生長(zhǎng)定量和 Matrigel^? 層表面或嵌入其中的 3D 多腫瘤球模型培養(yǎng)物的形態(tài)學(xué)研究-在培養(yǎng)箱內(nèi)部不受干擾得進(jìn)行。

圖 2（視頻）監(jiān)測(cè)多腫瘤球生長(zhǎng)并揭示腫瘤球形態(tài)隨時(shí)間的變化情況。接種 MCF-7 和 MDA-MB-231 細(xì)胞（1K 細(xì)胞/孔）并在 Matrigel^? 層上或嵌入 Matrigel^? 基底內(nèi)部形成多腫瘤球（3 天）。通過(guò)延時(shí)視頻監(jiān)測(cè)腫瘤球隨時(shí)間的生長(zhǎng)情況（形成后的 0-7 天），可見(jiàn)多腫瘤球出現(xiàn)圓形 (MCF-7) 和星形 (MDA-MB-231) 的形態(tài)學(xué)差異。

圖 3. 使用實(shí)時(shí)分析定量細(xì)胞類型依賴性無(wú)標(biāo)記生長(zhǎng)曲線。在 96 孔平底板中，將 MCF-7 和 MDA-MB-231 嵌入 Matrigel^? 基底(1K 細(xì)胞/孔)，等待 3 天形成腫瘤球。分隔的（黃色輪廓）DF 明場(chǎng)圖像和相應(yīng)的時(shí)程曲線顯示細(xì)胞類型特異性動(dòng)力學(xué)生長(zhǎng)曲線，并展示了喜樹(shù)堿對(duì)腫瘤球生長(zhǎng)的抑制作用。

使用無(wú)干擾型試劑進(jìn)行活力和毒性的實(shí)時(shí)多重測(cè)定，研究作用機(jī)制。
*僅在 Matrigel^? 層模型使用多腫瘤球時(shí)才能獲取熒光圖像。

圖 4. 通過(guò)動(dòng)力學(xué)、生長(zhǎng)和細(xì)胞健康多重檢測(cè)，確定細(xì)胞毒性與細(xì)胞抑制作用機(jī)制。在含有 Incucyte^? Annexin V 綠色染料 (1%) 的情況下，接種帶有 Nuclight 紅色標(biāo)記的 A549 細(xì)胞（2 K 細(xì)胞/孔），等待 3 天形成腫瘤球。在接下來(lái)的 6 天里，用不同濃度喜樹(shù)堿 (CMP) 或環(huán)己酰亞胺 (CHX) 處理腫瘤球并成像。(A) 在處理后第 4 天對(duì)明場(chǎng)（BF，上行）、Incucyte^?Nuclight 紅色染料（指示細(xì)胞活力的核限制性熒光蛋白 (FP)，紅色熒光，中間行）和 Incucyte^?Annexin 綠色染料（凋亡標(biāo)記物，綠色熒光，下行）圖像進(jìn)行對(duì)比。(B) 在 CMP 處理的腫瘤球中觀察到生長(zhǎng)緩慢（BF 區(qū)域的時(shí)程曲線），BF 邊界范圍內(nèi)整體紅色強(qiáng)度降低（紅色熒光時(shí)程曲線），以及平均綠色熒光強(qiáng)度的同步增加（綠色熒光時(shí)程曲線）。盡管 CHX 抑制腫瘤球生長(zhǎng)，RFP 表達(dá)水平仍然較高，然而綠色熒光強(qiáng)度少量增強(qiáng)，這表明觀察到少量的細(xì)胞死亡，這與已知細(xì)胞生長(zhǎng)抑制劑的預(yù)期相符。CMP 處理后使用 0-6 天的 AUC 數(shù)據(jù)得出的 EC₅₀ 表現(xiàn)出濃度依賴性的細(xì)胞活力喪失和細(xì)胞凋亡增加，而 CHX 的 EC₅₀ 值顯示，活力幾乎沒(méi)有變化，且細(xì)胞凋亡沒(méi)有增加，這與預(yù)期的作用機(jī)制相符。

圖 5. 在生理相關(guān)條件下進(jìn)行穩(wěn)定可重現(xiàn)的藥理學(xué)分析。帶有 Nuclight 紅色標(biāo)記的 MCF-7 多腫瘤球形成 3 天后，使用已知的細(xì)胞毒性化合物處理 7 天。采用孔板時(shí)程視圖可以快速觀察化合物處理對(duì)腫瘤球大?。?BF 面積）和活力（BF 內(nèi)紅色 FLU 強(qiáng)度）的影響。使用濃度響應(yīng)曲線可進(jìn)行處理后 0-7 天時(shí)程數(shù)據(jù)的曲線下面積 (AUC) 分析。所有化合物均能夠?qū)е履[瘤球的濃度依賴性生長(zhǎng)和活力抑制，化合物效力的排列順序?yàn)?CMP > CHX > OXA。

結(jié)合額外的細(xì)胞類型，重現(xiàn)腫瘤微環(huán)境，并研究細(xì)胞隨時(shí)間的變化。

圖 6.可視化并定量基質(zhì)細(xì)胞對(duì)多腫瘤球形態(tài)學(xué)的影響，并評(píng)估多腫瘤球內(nèi)部的免疫細(xì)胞介導(dǎo)毒性。(A) 將 MDA-MB-231 細(xì)胞接種到 96 孔平底板的 Matrigel^? 基底上，單獨(dú)培養(yǎng)或與 NHDF 共培養(yǎng)（比例 1:1，各接種 1K 細(xì)胞/孔），形成多腫瘤球（3 天）。Incucyte^?DF-明場(chǎng) (DF-BF) 圖像比較了單獨(dú)培養(yǎng)和共培養(yǎng)條件下培養(yǎng) 3 天的情況（細(xì)胞接種后 6 天）。注意 NHDF 對(duì)腫瘤球形態(tài)學(xué)的時(shí)間影響。(B) 將穩(wěn)定表達(dá)細(xì)胞質(zhì)限制性 GFP 的 BT474 細(xì)胞接種到 Matrigel^? 基底上（1K 細(xì)胞/孔），形成多腫瘤球（3 天），然后加入新鮮分離的 PBMC (E:T, 5:1) 和赫賽汀。Incucyte^?DF-BF 和熒光圖像（7 天）比較了 PBMC 存在（上圖）和不存在（下圖）的條件下赫賽汀對(duì)腫瘤球增殖的影響（黃色明場(chǎng) outline mask）。注意，PBMC 存在時(shí)，腫瘤球的熒光強(qiáng)度會(huì)減弱。時(shí)程曲線顯示，綠色熒光強(qiáng)度隨赫賽汀濃度增加呈依賴性降低，表面靶細(xì)胞生存力降低。赫賽汀濃度響應(yīng)曲線顯示了 HER2 陽(yáng)性和 HER2 陰性多腫瘤球的靈敏度差異（分別是 BT-474 和 MCF7）。