用于活細胞分析的細胞凋亡分析

什么是細胞凋亡？

細胞凋亡是正常組織發(fā)育和內(nèi)穩(wěn)態(tài)的重要過程，細胞通過該過程適時發(fā)生程序性細胞死亡。細胞凋亡信號傳遞的異常與各種人體病癥有關(guān)，包括癌癥、自身免疫性疾病和神經(jīng)退行性疾病。在大多數(shù)情況下，細胞凋亡誘導(dǎo)半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶 (Caspase) 激活和質(zhì)膜改變。Caspase-3 或 Caspase-7 的激活導(dǎo)致細胞不可逆地發(fā)生凋亡，被視為可靠的細胞凋亡標志物。質(zhì)膜磷脂酰絲氨酸 (PS) 對稱性的調(diào)節(jié)性損失也是典型的細胞凋亡標志物。瀕死細胞觸發(fā)細胞膜內(nèi)側(cè)的磷脂酰絲氨酸 (Phosphatidylserine, PS) 外翻到細胞表面，從而允許周圍的吞噬細胞對瀕死細胞進行早期吞噬識別。

研究人員已經(jīng)設(shè)計了許多酶促分析、酶標儀和流式細胞儀來測定 Caspase-3/7 激活或磷脂酰絲氨酸外翻。大多數(shù) Caspase-3/7 分析涉及熒光素酶、比色或熒光試劑底物，這些底物包含由酶識別的 DEVD (Asp-Glu-Val-Asp) 肽基序。Annexin V 是一種重組蛋白，對 PS 殘基具有高親和力和選擇性，可用于檢測細胞凋亡。使用 Annexin V 偶聯(lián)熒光探針進行的細胞凋亡分析已針對 PS 外翻檢測進行了優(yōu)化，并且最常通過流式細胞術(shù)進行測定。這些常用的細胞凋亡分析法的主要缺點在于：(1) 它們產(chǎn)生單一、（任意）用戶自定義的終點測量值；(2) 它們需要多個洗滌步驟或細胞分離，可能導(dǎo)致凋亡細胞的損失或?qū)е?PS 不對稱性的損失；(3) 由于信號背景隨時間推移而不斷增加，因此不適合進行長期測量。

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將活細胞分析和流式細胞儀結(jié)合到單一工作流程中，深入了解免疫細胞的殺傷機理。

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應(yīng)用

Incucyte^? 活細胞分析系統(tǒng)能夠在您的組織培養(yǎng)箱內(nèi)進行實時、自動化細胞凋亡分析。使用即混即讀的 Incucyte^? Caspase-3/7 和 Annexin V 染料同時實時檢測多種細胞凋亡途徑。將細胞凋亡信號與 Incucyte^? 高清相差圖像相關(guān)聯(lián)，為凋亡細胞死亡提供額外的生物學(xué)信息和形態(tài)驗證（例如細胞皺縮、質(zhì)膜出泡、細胞核固縮）。

Incucyte^? Caspase-3/7 染料為惰性、非熒光 (DEVD) 的底物，可自由穿過細胞膜，它們可被激活的 Caspase-3/7 裂解，釋放出綠色或紅色可結(jié)合 DNA 的熒光標記。通過熒光標記的細胞核的出現(xiàn)來識別凋亡細胞。
Incucyte^? Annexin V 染料標記有異常明亮且具有光穩(wěn)定性的 CF 染料，在與凋亡細胞中暴露的 PS 結(jié)合后，發(fā)出綠色、紅色、橙色或近紅外熒光信號。

使用 Incucyte^? 細胞凋亡分析法檢測腫瘤、免疫或神經(jīng)元培養(yǎng)物中的細胞凋亡。實時檢測經(jīng) TNFα 和放線菌酮處理的 Incucyte^? Nuclight 綠色標記的 MDA-MB-231 人乳腺癌細胞（左側(cè)視頻）經(jīng)喜樹堿處理的 Jurkat T 淋巴細胞（右側(cè)視頻）中的細胞凋亡。分別使用即混即讀的 Incucyte^? Caspase-3/7 紅色染料或 Annexin V 紅色染料將凋亡細胞標記為紅色。使用 Incucyte^? 活細胞分析系統(tǒng)對凋亡細胞進行實時定量。

Incucyte^? 細胞凋亡檢測原理

通過將即混即讀的 Incucyte^? Caspase-3/7 和 Annexin V 染料加入培養(yǎng)物中，實時檢測細胞凋亡
使用直觀的 Incucyte^? 圖像分析工具自動定量凋亡細胞
通過將 Incucyte^? Nuclight 核標記試劑或 Incucyte^? Cytotox 染料相結(jié)合，獲得多重細胞凋亡讀數(shù)與增殖或細胞毒性測定結(jié)果

關(guān)鍵優(yōu)勢

Incucyte^? 細胞凋亡分析方案的關(guān)鍵優(yōu)勢

使用延時成像實現(xiàn)細胞凋亡的可視化和定量?-觀察隨時間推移的細胞凋亡并使用直觀的 Incucyte^? 圖像分析工具對細胞凋亡進行定量。利用圖像和視頻顯示形態(tài)變化并驗證治療效果。
在培養(yǎng)箱內(nèi)自動分析細胞凋亡的時程-?確定處理效果如何以及何時發(fā)生作用，無需將細胞從培養(yǎng)箱的穩(wěn)定環(huán)境中取出 - 非常適合長期研究（0 至 10 天以上）。
簡單的即混即讀 96/384 孔板方案，無需細胞清洗、固定和分離操作?-?接種細胞，并將處理試劑與 Incucyte^? Caspase-3/7 或 Incucyte^? Annexin V 染料一起加入，在 Incucyte^? 活細胞分析系統(tǒng)中進行動態(tài)讀數(shù)。系統(tǒng)每次可讀取多達 6 × 384 孔板，可用于中/高通量的篩選。
通過兩種不同的途徑檢測和確認細胞凋亡?-?多重 Incucyte^? Caspase-3/7 和 Annexin V 染料，以驗證細胞凋亡機制。
包含增殖和細胞毒性測定的多重分析-??將 Incucyte^? 細胞凋亡分析與 Nuclight 試劑或 Cytotox 染料相結(jié)合，進行增殖/細胞毒性的多重測定?？煞奖愕貐^(qū)分細胞抑制性作用和細胞毒性處理作用。

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使用延時成像實現(xiàn)細胞凋亡的可視化和定量

圖 1. 使用 Incucyte^? 細胞凋亡分析和圖像分析工具對選定細胞中的細胞凋亡進行定量。（頂部最左側(cè)圖）在喜樹堿 (100 μM) 和 Incucyte^? Caspase-3/7 綠色染料存在下，HT-1080 肉瘤細胞的 Incucyte^? 圖像。請注意伴隨 Caspase-3/7 綠色熒光信號的特征性細胞出現(xiàn)皺縮和質(zhì)膜出泡。（底部最左側(cè)圖）Incucyte^? 圖像分析工具能夠?qū)Φ蛲瞿[瘤細胞（粉色 mask）進行自動計數(shù)。（頂部中間偏左側(cè)圖）在 Caspase-3/7 紅色染料存在下，經(jīng) TNFα 和放線菌酮處理的 MDA-MB-231 乳腺癌細胞的 Incucyte^?圖像。（底部中間偏左側(cè)圖）Incucyte^? 圖像分析工具能夠?qū)Φ蛲瞿[瘤細胞（淺藍色 mask）進行自動計數(shù)。（頂部中間偏右側(cè)圖）在喜樹堿 (1 μM) 和 Incucyte^? Annexin V 紅色染料存在下，Jurkat T 淋巴細胞的 Incucyte^? 圖像。（底部中間偏右側(cè)圖）自動圖像分析（藍色 mask）能夠直接檢測凋亡免疫細胞。（右上圖）在谷氨酸 (300 μM) 和 Incucyte^? Annexin V 綠色染料存在下，與星形膠質(zhì)細胞共培養(yǎng)的原代大鼠前腦神經(jīng)元的 Incucyte^? 圖像。將神經(jīng)元用 Incucyte^? Neurolight 紅色慢病毒進行選擇性標記。（右下圖）所分析的圖像（藍色 mask）陽性標記出凋亡細胞。

Automatic analysis of the timecourse of apoptosis within your incubator

在培養(yǎng)箱內(nèi)自動分析細胞凋亡的時程

圖 2. 自動、非侵入性地定量處理效果。Incucyte^? 細胞凋亡分析方案能夠?qū)?96/384 孔板中的每個孔進行自動成像和分析，提供隨時間變化的細胞毒性的微孔板讀數(shù)（左圖）。時間進程圖顯示處理效果呈濃度依賴性（中間圖）。將數(shù)據(jù)轉(zhuǎn)化為濃度響應(yīng)曲線，比較藥理學(xué)結(jié)果（右圖）。

簡單的即混即讀 96/384 孔板方案 - 無需細胞清洗、固定和分離操作

接種細胞，并將處理試劑與 Incucyte^? Caspase-3/7 或 Incucyte^? Annexin V 染料一起加入，在 Incucyte^? 活細胞分析系統(tǒng)中進行動態(tài)讀數(shù)。系統(tǒng)每次可讀取多達 6 × 384 孔板，可用于中/高通量的篩選

通過兩種不同的途徑檢測和確認細胞凋亡

圖 4. 通過兩個細胞凋亡讀數(shù)確認凋亡細胞死亡。同時檢測培養(yǎng)物中的 Caspase-3/7 和 Annexin V 信號。自動確定凋亡細胞死亡的時程。

包含增殖和細胞毒性測定的多重分析

圖 5. 利用活細胞無標記計數(shù)以及細胞毒性和增殖的時程和濃度依賴性定量進行細胞凋亡的多重分析。在含有 Incucyte^? Annexin V 綠色染料的情況下，使用喜樹堿 (1 μM) 或環(huán)己酰亞胺 (1 μM) 處理 HT-1080 纖維肉瘤細胞，以檢測 24 小時的凋亡細胞（圖中顯示死亡細胞 mask）。用于鑒別綠色（凋亡）細胞群的分類圖（第二列）、時程圖（第三列）和濃度響應(yīng)曲線（第四列）顯示了細胞毒性化合物與細胞抑制化合物的效果差異。

常見問題解答

我能夠?qū)λ屑毎愋偷募毎蛲鲞M行定量嗎？

是的，原則上是這樣。使用一系列貼壁和非貼壁細胞系對 Caspase-3/7 和 Annexin V 方案進行了優(yōu)化，因此應(yīng)當適用于所有細胞類型（包括癌細胞、免疫細胞和神經(jīng)元）。請注意，某些細胞類型可能缺乏 Caspase-3 的表達（例如 MCF-7 細胞）。對于這些細胞類型，我們建議使用 Incucyte^? Annexin V 試劑代替 Caspase-3/7 試劑進行細胞凋亡檢測。

我可以使用非貼壁細胞嗎？

可以。此處所述的方案和數(shù)據(jù)表明，可以對懸浮細胞系（例如 Jurkat 人 T 淋巴細胞）中的細胞凋亡進行定量。您可能需要包被樣品板以確保懸浮細胞保持在視野內(nèi)。已證明，多聚-L-鳥氨酸、多聚-D-賴氨酸或 Matrigel? 等包被劑效果良好。

我可以使用熒光探針預(yù)標記的細胞嗎？

可以。只要熒光團與 Incucyte^? 活細胞分析系統(tǒng)兼容并且不干擾所用 Incucyte^? Caspase 3/7 或 Annexin V 試劑發(fā)出的熒光即可。

我可以對多種細胞凋亡標志物進行多重測定嗎？

可以。此處所述的方案和數(shù)據(jù)表明，可以定量分析單個孔中的兩種細胞凋亡標志物（例如半胱天冬酶-3/7 激活和磷脂酰絲氨酸外翻）。為此，我們建議將 Incucyte^? Annexin V 紅色染料（產(chǎn)品目錄號 4641）與綠色 Incucyte^? Caspase-3/7 試劑（產(chǎn)品目錄號 4440）結(jié)合使用。

我可以將細胞凋亡與其他細胞健康讀數(shù)（例如細胞毒性）進行多重分析嗎？

可以。將 Incucyte^? Caspase-3/7 試劑（產(chǎn)品目錄號 4440）與 Incucyte^? 紅色 Cytotox 試劑（產(chǎn)品目錄號 4633）聯(lián)用或?qū)⑾鄬Φ募t色和綠色版本的 Incucyte^? Annexin V 試劑（產(chǎn)品目錄號 4641 或 4642）和 Incucyte^? Cytotox 試劑（產(chǎn)品目錄號 4632 或 4633）聯(lián)用。

我可以與碘化丙啶一起使用分析細胞凋亡嗎？

可以?？梢詫?Incucyte^? Annexin V 紅色染料（產(chǎn)品目錄號 4641）與碘化丙啶聯(lián)用。我們建議使用 Incucyte^? 系統(tǒng)的紅色通道定量碘化丙啶信號，并將紅色與綠色的光譜分離參數(shù)設(shè)置為 80%（更多信息參見《熒光染料優(yōu)化技術(shù)指南》）。***

我應(yīng)該使用什么 Incucyte^? 物鏡來定量分析細胞凋亡？

已同時使用 10 倍和 20 倍物鏡生成了數(shù)據(jù)。10 倍物鏡的優(yōu)勢在于視野更大，并減少了每孔所需的圖像數(shù)量。為獲得更高的空間分辨率，建議使用 20 倍物鏡。

我應(yīng)該使用特定的微孔板來檢測細胞凋亡嗎？

Incucyte^? 細胞凋亡分析方案可使用 Incucyte^? ZOOM 系統(tǒng)支持的任何透明面或黑面 96 孔或 384 孔透明底微孔板。此處所述的實驗采用 Corning 96 孔板（產(chǎn)品目錄號 3904）。

加入 Incucyte^? 細胞凋亡試劑后，是否需要洗滌或固定細胞？

不需要。Incucyte^? Annexin V 試劑專為使用 Incucyte^? 系統(tǒng)進行活細胞成像而配制。即混即讀方案操作簡單。無需洗滌或固定。

可以在分析期間使用我的標準細胞培養(yǎng)基嗎？

可以。將 Incucyte^? Annexin V 或 Caspase-3/7 試劑與 Incucyte^? 系統(tǒng)配合使用時，無需使用專門的分析培養(yǎng)基或緩沖液。集成式 Incucyte^? 圖像分析工具使您能夠最大程度地減小可能由所使用的培養(yǎng)基、試劑或檢測試劑引起的任何背景熒光。但是請注意，Annexin V 與外翻的磷脂酰絲氨酸的結(jié)合具有 Ca2+ 依賴性，因此需要確保分析培養(yǎng)基的 Ca2+ 濃度 ≥ 1 mM。

使用 Incucyte^? 細胞凋亡試劑時，可以進行細胞計數(shù)嗎？

我們建議在使用 Incucyte^? Caspase 3/7 細胞凋亡試劑時對凋亡細胞進行計數(shù)。Caspase-3/7 試劑標記凋亡細胞的細胞核，因此很容易區(qū)分相鄰凋亡細胞的離散標記的細胞核。而 Incucyte^? Annexin V 試劑會標記整個細胞表面。因此，區(qū)分相鄰細胞可能具有挑戰(zhàn)性。我們建議使用 Annexin V 試劑對總熒光面積進行定量，因為這是一種更穩(wěn)定的方法。

我可以將細胞凋亡檢測結(jié)果歸一化至細胞增殖檢測結(jié)果嗎？

是的，細胞凋亡的檢測結(jié)果可歸一化至 Incucyte^? 無標記細胞匯合度測定結(jié)果。盡管某些治療可能會導(dǎo)致顯著的細胞破碎或細胞相位差變化，但我們發(fā)現(xiàn) Incucyte^? 相位差匯合度指標可為測定過程中的總細胞數(shù)提供信息豐富的估計值。

也可以在細胞凋亡測定結(jié)束時歸一化至包含對象的 DNA 總數(shù)。為此，我們建議使用 Vybrant^? DyeCycle? 綠色染色劑 (ThermoFisher)。該染色劑可直接加入測定孔中，無需吸入含有細胞凋亡試劑的培養(yǎng)基或用其洗滌。

訂購信息

Incucyte^? Caspase 3/7 和 Annexin V 染料經(jīng)過充分驗證，可與 Incucyte^? 活細胞分析系統(tǒng)配合使用。此外，它們可以與我們的 Incucyte^? Nuclight 核標記試劑系列或 Incucyte^? Cytotox 染料聯(lián)合使用，用于對同一孔內(nèi)的增殖和細胞毒性以及細胞凋亡進行多重測定。

產(chǎn)品	數(shù)量	產(chǎn)品目錄號
用于細胞凋亡分析的 Incucyte^? Caspase-3/7 綠色染料	1 瓶：20 μL（100-200 次檢測）	4440
用于細胞凋亡分析的 Incucyte^? Caspase-3/7 紅色染料	1 瓶：20 μL（100-200 次檢測）	4704
用于代謝檢測的 Incucyte^? Caspase-3/7 染料	1 瓶：20 μL（100-200 次檢測）	4776
Incucyte^? Annexin V 綠色染料	1 瓶：100-200 次檢測	4642
Incucyte^? Annexin V 紅色染料	1 瓶：100-200 次檢測	4641
Incucyte^? Annexin V 橙色染料	1 瓶：100-200 次檢測	4759
Incucyte^? Annexin V NIR 染料	1 瓶：100-200 次檢測	4768
Incucyte^? MMP 橙色試劑盒	1 盒： MMP 橙色試劑：30 μL（200 次檢測） FCCP：10 μL（16 次檢測）寡霉素：10 μL（16 次檢測）	4775
Incucyte^?Cytotox 綠色染料	5 瓶：5 μL（100 次檢測）	4633
Incucyte^? Cytotox 紅色染料	5 瓶：5 μL（100 次檢測）	4632
Incucyte^?Cytotox NIR 染料	1 瓶：100 μL（500-1000 次檢測）	4846