使用 Incucyte? 和 iQue? 定量分析動(dòng)態(tài) T 細(xì)胞功能
T 細(xì)胞在獲得性免疫中起到至關(guān)重要的作用，其獨(dú)特的表面受體，使其可以感知和響應(yīng)不同類型的病原微生物，防御有害的靶細(xì)胞，如突發(fā)性腫瘤細(xì)胞。T 細(xì)胞的活化和增殖是免疫應(yīng)答作用和程度調(diào)節(jié)的基礎(chǔ)，需要?jiǎng)討B(tài)模型來理解 T 細(xì)胞對(duì)抗感染或疾病的生物學(xué)特性。
Incucyte? 活細(xì)胞分析系統(tǒng)和 iQue? 高通量流式細(xì)胞儀可用于評(píng)估和定量 T 細(xì)胞的關(guān)鍵功能，包括活化和聚集、抗體內(nèi)化實(shí)驗(yàn)、趨化性、細(xì)胞因子的產(chǎn)生，以及復(fù)雜共培養(yǎng)模型的評(píng)估，如免疫細(xì)胞殺傷和跨內(nèi)皮細(xì)胞遷移實(shí)驗(yàn)。
T 細(xì)胞應(yīng)用
使用相差成像和活細(xì)胞 ICC（抗-CD71 fabflur-488）對(duì) PBMC 活化進(jìn)行可視化處理。用抗-CD3 和 IL-2，或?qū)φ仗幚?PBMC（30, 000個(gè)/孔），并用抗 CD-71-Fabfluor-488 標(biāo)記。a) 無標(biāo)記相差成像檢測(cè)未活化和活化的 PBMC 之間的形態(tài)學(xué)差異；相差成像結(jié)合活細(xì)胞 ICC 的結(jié)果顯示，在活化的細(xì)胞中 CD71+ 有所上調(diào)。b) 在大細(xì)胞亞群和小細(xì)胞亞群中，活化可誘導(dǎo)細(xì)胞大小增加、細(xì)胞偏心率增加和 CD71+ 上調(diào)。
采用 iQue??高通量流式細(xì)胞儀和 ForeCyt??軟件進(jìn)行 T 細(xì)胞活化評(píng)估。在不同的處理?xiàng)l件下，T 細(xì)胞激活百分比和分泌 IFNγ 水平的劑量和時(shí)間響應(yīng)。每種供試化合物均觀察到獨(dú)特的 T 細(xì)胞活化標(biāo)志物模式。
利用 Incucyte? 免疫細(xì)胞殺傷實(shí)驗(yàn)可視化免疫細(xì)胞/腫瘤細(xì)胞的相互作用。(1) 細(xì)胞毒性 T 細(xì)胞（較?。┖蜆?biāo)記的腫瘤細(xì)胞（較大，紅色）之間的物理接觸。T 淋巴細(xì)胞分裂。(2) 腫瘤細(xì)胞被細(xì)胞毒性 T 淋巴細(xì)胞攻擊：“死亡之吻”。(3) 腫瘤細(xì)胞形成胞質(zhì)顆粒，半胱天冬酶 3/7 標(biāo)記（綠色），核固縮，細(xì)胞死亡。(4) 腫瘤細(xì)胞有絲分裂：一個(gè)細(xì)胞分裂為兩個(gè)。
使用 Incucyte? 免疫細(xì)胞殺傷試驗(yàn)實(shí)時(shí)檢測(cè)腫瘤細(xì)胞的死亡和增殖（可選）。Incucyte? 軟件易于操作，可直接根據(jù)圖像檢測(cè)凋亡的腫瘤細(xì)胞（綠色無題，黃色輪廓），實(shí)時(shí)對(duì)活腫瘤細(xì)胞計(jì)數(shù)（Incucyte? NucLight 紅色染料標(biāo)記的細(xì)胞核，藍(lán)色輪廓）。動(dòng)力學(xué)讀數(shù)顯示治療效果呈時(shí)間依賴性。
靶細(xì)胞和細(xì)胞因子時(shí)間進(jìn)程分析。用 PMBCS 去除 SKOV-3 NucLight 綠色細(xì)胞，使用 CD3/CD28 磁珠 (Dynabead) 進(jìn)行活化。(A) 采用 Incucyte? 分析的靶細(xì)胞計(jì)數(shù)的時(shí)間進(jìn)程。使用 TCA 試劑盒的 Qbead 組分（Qbeads 或 Assay Builder：IFNγ，選項(xiàng) 1 和 TNFα，選項(xiàng) 2）對(duì)僅使用 10 μL/天上清液樣品的 (B) IFNγ 和 (C) TNFα 的細(xì)胞因子時(shí)間進(jìn)程數(shù)據(jù)進(jìn)行定量分析/(D) 根據(jù)靶細(xì)胞計(jì)數(shù) (Incucyte?) 和細(xì)胞因子 (iQue??3) 的經(jīng)時(shí)變化繪制的 AUC 濃度響應(yīng)曲線。
CD3xCD19 BiTE 抗體誘導(dǎo)細(xì)胞毒性和靶細(xì)胞聚集。Ramos NucLight 綠色細(xì)胞與 PBMC 共同接種，使用 BiTE 抗體 (anti-hCD3xCD19) 或?qū)φ湛贵w (anti-hCD3xβGAL) 激活。在 (A) 對(duì)照抗體或 (B) BiTE 抗體的存在下 72 小時(shí)的代表性圖像。跟蹤靶細(xì)胞數(shù)量 (C) 和聚集 (E) 的 Incucyte? 時(shí)間進(jìn)程數(shù)據(jù)（每 3 小時(shí)采集一次圖像）。采用包括亮度和大小的綠色累積強(qiáng)度度量 (GCU × μm2) 的折射率變化來定量靶細(xì)胞。與對(duì)照抗體相比，BiTE 抗體存在時(shí)靶細(xì)胞殺傷 (D) 和聚集 (F) 的 72 小時(shí)濃度響應(yīng)曲線。
活化的 PBMC 對(duì)腫瘤球增殖的影響。將穩(wěn)定表達(dá)核限制性 RFP 的 A549 腫瘤細(xì)胞接種在一個(gè)圓底 ULA 96 孔板中，培養(yǎng) 3 天，待其形成腫瘤球。腫瘤球形成后，在含或不含 Anti-CD3 和 IL-2 抗體混合物的條件下，與新分離的 PBMC 進(jìn)行共培養(yǎng)。Incucyte? HD 相位圖和熒光圖像顯示了 PBMC 在不含抗-CD3 和 IL-2 抗體（未活化，上圖）和含抗-CD3 和 IL-2 抗體（已活化，下圖）的情況下對(duì)腫瘤球增殖的影響對(duì)比。注意到，活化的 PBMC 存在時(shí)，腫瘤球的熒光強(qiáng)度明顯減弱。時(shí)程圖顯示了腫瘤球的細(xì)胞毒性（根據(jù)熒光強(qiáng)度隨時(shí)間的損失來定量）。數(shù)據(jù)收集時(shí)間為 7 天，每間隔 6 小時(shí)采集一次圖像。每個(gè)數(shù)據(jù)點(diǎn)代表平均值 ± SEM，n = 3 孔。
白細(xì)胞滲出的可視化處理。將 CD3/CD28 Dynabead 活化的原代 T 細(xì)胞接種到單層 HUVEC 細(xì)胞（由纖連蛋白培養(yǎng)）上，使用 Incucyte? 系統(tǒng)每分鐘采集一次圖像。黃色和橙色箭頭表示白細(xì)胞在 HUVEC 細(xì)胞之間移動(dòng)，最終沿著 ClearView 插入物的孔隙（藍(lán)色圓圈）移動(dòng)。
原代 T 細(xì)胞向 CXCL12 外滲。將 CD3/CD28 Dynabead 活化的原代 T 細(xì)胞接種到纖連蛋白培養(yǎng)的 HUVEC 單層膜上。然后，將含 T 細(xì)胞的插入物（HUVEC 單層共培養(yǎng)物）在指示濃度下暴露于 CXCL12 梯度中。使用 Incucyte? ZOOM 每 30 分鐘采集一次圖像，并進(jìn)行相位分析。在 t = 6 小時(shí)進(jìn)行藥理學(xué)反應(yīng)分析。每個(gè)數(shù)據(jù)點(diǎn)代表平均值 ± SEM，n = 4
參考文獻(xiàn)
集群
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免疫細(xì)胞殺傷
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