利用實時活細胞分析了解巨噬細胞的功能
巨噬細胞在傳染病、癌癥、神經(jīng)系統(tǒng)疾病和創(chuàng)傷愈合的免疫調(diào)節(jié)中發(fā)揮著關(guān)鍵作用，可對多種細胞信號做出響應(yīng)，以調(diào)節(jié)反應(yīng)。巨噬細胞以組織特異性形態(tài)（如 Kupffer 細胞和小膠質(zhì)細胞）存在于身體的各個組織中。在組織中，巨噬細胞們負責清除和吞噬微生物和凋亡細胞，充當宿主防御的中心角色。
Incucyte? 活細胞分析系統(tǒng)已被用來探究巨噬細胞的功能，通過評估細胞形態(tài)學和表面標志物來研究細胞分化、趨化性、吞噬作用和胞葬作用，以更好地了解巨噬細胞在健康和疾病中發(fā)揮的作用。
分化監(jiān)測
分化確認。監(jiān)測永生化 THP-1 細胞和血源性原代單核細胞在分化過程中的形態(tài)學變化。 THP-1 細胞暴露于 5 ng/mL PMA 48 小時后分化成 M0 巨噬細胞。原代單核細胞在 50 ng/mL GM-CSF 中培養(yǎng) 6 天后，在 1 ng/mL LPS + 20 ng/mL IFN-γ 中繼續(xù)培養(yǎng)一天后可分化成類-M1 表型的細胞，或在 50 ng/mL M-CSF 中培養(yǎng) 6 天，然后在 20 ng/mL IL-4 中繼續(xù)培養(yǎng)一天后分化成類-M2 表型的細胞。注意細胞形態(tài)與之前研究中的發(fā)現(xiàn)一致 (Young et al, J Immunol, 1990)；M1 細胞群呈現(xiàn)煎蛋形態(tài)，M2 細胞群為煎蛋形態(tài)和梭形細胞的混合形態(tài)。
分化過程跟蹤。相位圖中顯示了人 iPSC-源性單核細胞（0-7 天）分化中的形態(tài)。該細胞最終產(chǎn)生分化的人 iPSC-源性巨噬細胞（含有大囊泡）。加入 100 ng/mL M-CSF 以維持培養(yǎng)基至少 7 天，實現(xiàn)細胞分化。
對形態(tài)和細胞表面標志物進行可視化處理用于研究細胞分化情況。在CD11b、CD14 或 CD40 ?復合Incucyte? Fabfluor-488 抗體存在的情況下，將 THP-1 單核細胞暴露于培養(yǎng)基（未分化）、維生素 D3 或 PMA 中。與培養(yǎng)基單獨處理或維生素 D3 處理的細胞相比，PMA 處理后細胞形態(tài)顯示出明顯的變化（高清相差圖片）。動態(tài)圖突出顯示了不同處理條件下，細胞表面蛋白表達的差異性和時間依賴性。
定量分析趨化性
單核細胞成熟的生物學意義。將 THP-1 細胞（初始型或 PMA 誘導分化的 M0 細胞）接種到涂覆有纖連蛋白的 ClearView 趨化性膜上。然后，將細胞暴露于 C5a 梯度中，使用 Incucyte?系統(tǒng)每小時采集一次圖像。在 t = 30 h 時進行藥理學反應(yīng)分析。分化后的類巨噬細胞 THP-1 細胞對 C5a 有很強的濃度依賴性反應(yīng)，分化前 THP-1 對 C5a 產(chǎn)生較弱的反應(yīng)，或未觀察到反應(yīng)。
巨噬細胞趨化性動態(tài)監(jiān)測的重要性。原代血單核細胞分化為類-M2 表型；培養(yǎng)環(huán)境為 50 ng/mL M-CSF 中培養(yǎng) 6 天，然后在 20 ng/mL IL-4 中繼續(xù)培養(yǎng)一天。巨噬細胞接種到涂覆有 Matrigel 的 ClearView 趨化性膜上，然后暴露于 C5a 梯度中，使用 Incucyte?系統(tǒng)每 2 小時采集一次圖像。進行底部相位分析，并在 4.5 h 和 11 h 時進行藥理學反應(yīng)測定。注意，在較高濃度下，由于響應(yīng)延遲，C5a 效價發(fā)生了顯著的時間依賴性變化，這是一種特異性反應(yīng)，在中性粒細胞中未觀察到此類反應(yīng)。
定量分析吞噬作用
吞噬作用的定量分析。iPSC 源巨噬細胞 (Axol Bioscience) 以時間和細胞數(shù)量依賴性方式吞噬 Incucyte? pHrodo? Green E. coli Bioparticles? 染料偶聯(lián)物。 ?每個孔中有 100 μg pHrodo? Green E. coli Bioparticles?，iPSC 源巨噬細胞的相差和熒光融合圖像顯示了隨時間的推移 Bioparticles? 的被細胞攝取的情況。 ?在每張圖像下方是相應(yīng)的 masked-image，強調(diào)使用分割來完全定量吞噬作用動力學。 ?iPSC 源巨噬細胞使用單一 pHrodo? Green E. coli Bioparticle（100 μg/孔）獲得的吞噬作用時間進程曲線呈現(xiàn)出細胞數(shù)量依賴性。
抗-CD47 誘導的 CCRF 細胞吞噬作用。標記的 CCRF-CEM 細胞經(jīng)濃度遞增的抗-CD47 抗體 (B6H12.2) 處理后，加入到人骨髓源巨噬細胞中（BMDM；數(shù)值表示為平均值 ± SEM，n = 4）。
巨噬細胞內(nèi)細胞的成像和定量。J774.A1 巨噬細胞內(nèi)吞噬的 Jurkat 細胞顯示出高熒光強度，與細胞吞噬量成比例。以 2 分鐘為間隔快速成像可制作個體吞噬事件的視頻。
定量分析胞葬作用
分化決定吞噬能力。THP-1 細胞暴露于 200 nM PMA 24 小時、暴露于 200 nM PMA 中 24 小時 + 20 ng/mL IFNγ + 1 μg/mL LPS，或暴露于 200 nM PMA 中 24 小時 + 20 ng/mL IL-4，分別分化為 M0、M1 或 M2 巨噬細胞。然后，將細胞與 pHrodo Red 標記的凋亡 Jurkat 細胞共培養(yǎng)，利用被吞噬的 Jurkat 細胞的熒光信號評價分化的巨噬細胞的吞噬能力。數(shù)據(jù)顯示，分化為 M0 和 M2 的 THP-1 細胞有顯著更高的吞噬能力，該結(jié)果與 M2 巨噬細胞的抗炎功能一致。
參考文獻
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巨噬細胞與傳染病
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趨化作用
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