研究免疫細(xì)胞殺傷
了解患者自身腫瘤免疫系統(tǒng)在保護(hù)身體抵御腫瘤方面的作用至關(guān)重要。 這種抗腫瘤反應(yīng)的一個(gè)關(guān)鍵組成部分在于某些免疫細(xì)胞（如細(xì)胞毒性 T 細(xì)胞和自然殺傷細(xì)胞）能夠通過(guò)免疫細(xì)胞殺傷 (ICK) 過(guò)程誘導(dǎo)惡性細(xì)胞死亡。因此，體外模擬 ICK 十分重要。有多種傳統(tǒng)技術(shù)可用于評(píng)估 ICK，例如傳統(tǒng)的流式細(xì)胞術(shù)和生化讀數(shù)。這些技術(shù)雖然實(shí)用，但對(duì)細(xì)胞動(dòng)態(tài)相互作用的了解有限。
- “終點(diǎn)”固定和染色方案非常耗時(shí)，且每個(gè)時(shí)間點(diǎn)只產(chǎn)生單個(gè)圖像
- 需要多個(gè)清洗步驟，并且必須使用放射性或抗體標(biāo)記進(jìn)行定量
- 需要連接來(lái)自不同樣品（分析孔）的數(shù)據(jù)以構(gòu)建時(shí)程，可能會(huì)引入偽跡
- 失去環(huán)境控制，導(dǎo)致細(xì)胞發(fā)生變化，這可能產(chǎn)生不理想和誤導(dǎo)性的實(shí)驗(yàn)結(jié)果
使用 Incucyte? 免疫細(xì)胞殺傷分析方案可輕松實(shí)現(xiàn)對(duì)免疫細(xì)胞和癌細(xì)胞的動(dòng)態(tài)相互作用的可視化、定量分析和理解。該分析可作為現(xiàn)有的免疫或腫瘤免疫學(xué)方案的補(bǔ)充，使用非侵入性、非破壞性平臺(tái)分析細(xì)胞健康、表型、亞群和功能，為免疫細(xì)胞、抗體功能和殺傷提供新信息。
應(yīng)用
Incucyte? 免疫細(xì)胞殺傷實(shí)驗(yàn)
Incucyte? 免疫細(xì)胞殺傷實(shí)驗(yàn)將實(shí)時(shí)自動(dòng)分析與非干擾性活細(xì)胞試劑相結(jié)合，在您的組織培養(yǎng)箱中就可對(duì)免疫細(xì)胞介導(dǎo)的腫瘤細(xì)胞殺傷進(jìn)行直接多重測(cè)量。此靈活分析平臺(tái)非常適合測(cè)定：
- 細(xì)胞毒性 T 細(xì)胞殺傷
- 抗體依賴性細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞毒性 (ADCC)
- 腫瘤球模型中的免疫細(xì)胞殺傷
使用 Incucyte? 活細(xì)胞分析系統(tǒng)采集的延時(shí)視頻可通過(guò)傳統(tǒng) 2D 和更復(fù)雜的 3D 模型對(duì)腫瘤細(xì)胞殺傷作用進(jìn)行實(shí)時(shí)可視化。
首先可觀察到抗 CD3 抗體和 IL-2 活化的 PBMC T 細(xì)胞亞群對(duì)靶標(biāo) SK-OV-3 腫瘤細(xì)胞發(fā)揮殺傷作用。使用 Incucyte? Nuclight 紅色慢病毒對(duì) SK-OV-3 癌細(xì)胞進(jìn)行標(biāo)記，可以直接計(jì)數(shù)活腫瘤細(xì)胞數(shù)隨時(shí)間的變化。添加 Incucyte? Caspase-3/7 試劑可以同時(shí)檢測(cè)發(fā)生凋亡的細(xì)胞（綠色熒光）。
之后可使用 Incucyte? Cell-by-Cell 分析軟件定量分析并繪制總靶標(biāo)和效應(yīng)細(xì)胞增殖情況以及靶標(biāo)的凋亡指數(shù)。在加入 Incucyte? Annexin V 綠色染料的情況下，將 Nuclight 紅色標(biāo)記的 Ramos 細(xì)胞與活化的人 PBMC 共培養(yǎng)，從而對(duì)亞群靶細(xì)胞增殖、靶細(xì)胞死亡和免疫細(xì)胞增殖進(jìn)行定量分析。最后，觀察并定量分析了免疫細(xì)胞對(duì)球體模式下 A549 癌細(xì)胞的免疫細(xì)胞殺傷。將 Nuclight 紅色標(biāo)記的 A549 球體模型與未活化和活化的 PBMCs?共培養(yǎng)。
Incucyte? 免疫細(xì)胞殺傷檢測(cè)原理
- 靶腫瘤細(xì)胞與所選擇的免疫細(xì)胞（例如，T 細(xì)胞或人外周血單核細(xì)胞；PBMCs）共培養(yǎng)。
- 通過(guò)將即混即讀的 Incucyte? Caspase-3/7 綠色/紅色試劑或 Incucyte? Annexin V 紅色/綠色試劑添加到培養(yǎng)物中，即可直接實(shí)時(shí)檢測(cè)腫瘤細(xì)胞的死亡情況。
- 自動(dòng)圖像分析能夠?qū)δ[瘤細(xì)胞死亡進(jìn)行選擇性定量?？蛇x：通過(guò)使用多種 Incucyte? Nuclight 標(biāo)記試劑標(biāo)記靶細(xì)胞，從而實(shí)現(xiàn)腫瘤細(xì)胞同時(shí)計(jì)數(shù)。使用 Incucyte? Cytolight 紅色或綠色快速試劑可以識(shí)別不易標(biāo)記的細(xì)胞。
- 使用 Incucyte? Cell-By-Cell 分析軟件模塊（產(chǎn)品目錄號(hào)9600-0031）進(jìn)行分析，可以對(duì)標(biāo)記的靶細(xì)胞群和未標(biāo)記的效應(yīng)細(xì)胞群（增殖和死亡）進(jìn)行定量。對(duì)于貼壁靶細(xì)胞，該軟件使用戶能夠在靶細(xì)胞存在的情況下追蹤效應(yīng)細(xì)胞群。
關(guān)鍵優(yōu)勢(shì)
- 定量分析實(shí)時(shí)動(dòng)態(tài)相互作用?-?檢測(cè)和觀察復(fù)雜共培養(yǎng)中免疫細(xì)胞和癌細(xì)胞之間的相互作用
- 分析腫瘤細(xì)胞死亡和活力?-?使用非干擾性試劑和直觀的圖像分析工具可對(duì)腫瘤或免疫細(xì)胞的增殖和凋亡進(jìn)行選擇性定量分析
- 通過(guò)靈活分析形式研究免疫細(xì)胞殺傷?-?評(píng)估廣泛的相關(guān)免疫細(xì)胞和腫瘤細(xì)胞共培養(yǎng)模型 - 在 2D 或 3D 中
- 使用優(yōu)化方案提升分析效率?-?在 96 孔或 384 孔板中使用優(yōu)化的試劑和方案評(píng)估免疫細(xì)胞殺傷作用 - 無(wú)需細(xì)胞清洗、分離或進(jìn)行放射性標(biāo)記
定量分析實(shí)時(shí)、動(dòng)態(tài)的細(xì)胞相互作用
觀察和定量分析免疫細(xì)胞和癌細(xì)胞之間的動(dòng)態(tài)相互作用，從而揭示復(fù)雜共培養(yǎng)模型中的細(xì)胞間相互作用和免疫突觸。
圖 1A. 利用 Incucyte? 免疫細(xì)胞殺傷實(shí)驗(yàn)可視化免疫細(xì)胞/腫瘤細(xì)胞的相互作用。(1) 細(xì)胞毒性 T 細(xì)胞（較小）和標(biāo)記的腫瘤細(xì)胞（較大，紅色）之間的物理接觸。T 淋巴細(xì)胞分裂。(2) 腫瘤細(xì)胞被細(xì)胞毒性 T 淋巴細(xì)胞攻擊：“死亡之吻”。(3) 腫瘤細(xì)胞形成胞質(zhì)顆粒，Caspase 3/7 標(biāo)記（綠色），核固縮，細(xì)胞死亡。(4) 腫瘤細(xì)胞有絲分裂：一個(gè)細(xì)胞分裂為兩個(gè)。
圖 1B. 使用 Incucyte? Fabfluor-488 可視化并定量分析混合培養(yǎng)物中免疫細(xì)胞與腫瘤細(xì)胞的相互作用。將帶有 Cytolight 紅色標(biāo)記的 A549 腫瘤細(xì)胞與 Incucyte? Fabfluor-488-α-CD45 和 Incucyte? Opti-Green 標(biāo)記的總淋巴細(xì)胞群的預(yù)活化或未活化的 PBMC 混合。添加 PBMC 后 2 小時(shí)采集的圖像顯示了 CD45+ 細(xì)胞（綠色）和 A549 細(xì)胞（紅色）之間的相互作用。相互作用的定量分析結(jié)果（疊加，圖像中的黃色 mask）顯示，活化的效應(yīng)細(xì)胞與靶細(xì)胞的相互作用明顯增加，表明細(xì)胞參與了對(duì)腫瘤細(xì)胞的免疫殺傷（如柱狀圖所示）。使用 Incucyte? Cell-By-Cell 分析軟件模塊進(jìn)行分析。
分析腫瘤細(xì)胞死亡和活力
使用無(wú)干擾性試劑和直觀的 Incucyte? 圖像分析工具定量分析腫瘤細(xì)胞的活力和死亡或免疫細(xì)胞增殖。
圖 2A. 使用 Incucyte? 免疫細(xì)胞殺傷實(shí)驗(yàn)進(jìn)行貼壁腫瘤細(xì)胞和效應(yīng)細(xì)胞增殖、死亡和亞群分析。在含有 Incucyte? Annexin V 橙色染料、Incucyte? Fabfluor-488-α-CD45 抗體復(fù)合物和 Incucyte? Opti-Green 背景抑制劑的情況下，使用 Incucyte? Nuclight NIR 慢病毒轉(zhuǎn)染的 A549 細(xì)胞與數(shù)量增加的活化（頂行）或非活化（底行）的 PBMC 共培養(yǎng)。 定量分析 NIR（藍(lán)色）細(xì)胞核顯示靶細(xì)胞增殖，橙色熒光區(qū)域 (Annexin V) 顯示靶細(xì)胞死亡。使用 Incucyte? Cell-by-Cell 分析軟件模塊可在存在腫瘤細(xì)胞的情況下定量總效應(yīng)細(xì)胞數(shù)，無(wú)需標(biāo)記。添加 Fabfluor-CD45 表明 > 80% 是 CD45 陽(yáng)性免疫細(xì)胞。
圖 2B. 使用 Incucyte? Cell-by-Cell 分析模塊測(cè)定非貼壁靶細(xì)胞和效應(yīng)細(xì)胞增殖、死亡，以及進(jìn)行亞群分析。在含有 Incucyte? Annexin V NIR 染料、Incucyte? Fabfluor-488-α-CD8 抗體復(fù)合物和 Incucyte? Opti-Green 背景抑制劑的情況下，使用 Incucyte? Nuclight 橙色慢病毒試劑轉(zhuǎn)染的 Ramos 細(xì)胞與活化或非活化（使用 CD3/IL2）的 PBMC 共培養(yǎng)。定量分析橙色（紅色）細(xì)胞核顯示靶細(xì)胞增殖，NIR（藍(lán)色）熒光區(qū)域顯示靶細(xì)胞死亡。使用 Incucyte? Cell-by-Cell 分析軟件模塊可定量分析并繪制總目標(biāo)細(xì)胞數(shù)和效應(yīng)細(xì)胞數(shù)，以及靶細(xì)胞的凋亡指數(shù)隨時(shí)間變化的圖表。
使用高度靈活的分析形式研究免疫細(xì)胞殺傷
評(píng)估多種相關(guān)模型，包括與貼壁或懸浮腫瘤細(xì)胞與 PBMCs、細(xì)胞毒性 T 淋巴細(xì)胞和 NK 細(xì)胞的共培養(yǎng)模型。在 T 細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞毒性和抗體依賴性細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞毒性 (ADCC) 形式中選擇使用所需的效應(yīng)細(xì)胞和靶細(xì)胞，定量分析并可視化腫瘤球模型中的免疫細(xì)胞隨時(shí)間的殺傷作用。
圖 3A. ADCC: 在免疫細(xì)胞殺傷腫瘤球模型中，曲妥珠單抗（Herceptin?，赫賽?。┱T導(dǎo)免疫細(xì)胞殺傷 SKOV-3 卵巢癌細(xì)胞：對(duì) HER2 陽(yáng)性的 Nuclight 紅色標(biāo)記 SKOV-3 球體（2500 個(gè)細(xì)胞/孔）接種 PBMC（6250 個(gè)細(xì)胞/孔）并用赫賽?。ò邢?HER2 受體的 mAb）處理，連續(xù)拍照 10 天 (A)。通過(guò)熒光強(qiáng)度 (B) 評(píng)估赫賽汀對(duì) SKOV-3 腫瘤球生長(zhǎng)的抑制。
圖 3B. ADCC: 曲妥珠單抗（赫賽?。┱T導(dǎo)免疫細(xì)胞殺傷 SKOV-3 卵巢癌細(xì)胞。PBMC 與 Nuclight 紅色標(biāo)記 SKOV-3（HER2 陽(yáng)性）或 Nuclight 紅色標(biāo)記 A549（HER2 陰性）腫瘤細(xì)胞共培養(yǎng)。在 SKOV-3 (A) 中曲妥珠單抗誘導(dǎo)隨時(shí)間對(duì)腫瘤細(xì)胞增殖產(chǎn)生受濃度影響的抑制作用，但對(duì) A549 (B) 細(xì)胞沒(méi)有作用。曲妥珠單抗抑制 SKOV-3 細(xì)胞增殖的濃度-響應(yīng)曲線 (C)。含有和不含抗體（添加后 72 小時(shí)）的情況下未處理（頂部）和 masked-image（底部）示例 (D)。
通過(guò)優(yōu)化的方案提升分析效率
圖 4A.簡(jiǎn)化工作流程，最大程度地獲取信息。在 2D 或 3D 共培養(yǎng)模型中，將自動(dòng)化圖像和分析的強(qiáng)大功能與經(jīng)過(guò)實(shí)驗(yàn)室測(cè)試的方案相結(jié)合，適用于貼壁或非貼壁靶腫瘤細(xì)胞
常用的免疫細(xì)胞殺傷分析方法
用于評(píng)估免疫細(xì)胞殺傷癌細(xì)胞的常用方法通常為終點(diǎn)法，需要分離細(xì)胞（例如流式細(xì)胞術(shù)）或測(cè)定腫瘤細(xì)胞活力的間接讀數(shù)（例如 LDH、GAPDH 釋放實(shí)驗(yàn)）或免疫細(xì)胞活化 (ELISpot)。這些讀數(shù)通常均不基于圖像。下表顯示了一些常見方法的功能和挑戰(zhàn)
Incucyte? 免疫細(xì)胞殺傷分析 | 流式細(xì)胞儀 | 51 Cr 釋放實(shí)驗(yàn) | GAPDH/LDH 釋放實(shí)驗(yàn) | DELFIA? TRF 檢測(cè) | ELISpot | ADCC 報(bào)告基因生物測(cè)定 (Promega) | |
|---|---|---|---|---|---|---|---|
實(shí)時(shí)細(xì)胞可視化 | ? | ||||||
集成分析 | ? | ? | ? | ||||
直接檢測(cè)腫瘤細(xì)胞死亡 | ? | ? | |||||
腫瘤細(xì)胞活力測(cè)定 | ? | ? | ? | ? | ? | ||
評(píng)估長(zhǎng)期殺傷作用 >24 小時(shí) | ? | ? | |||||
靈活選擇靶細(xì)胞和效應(yīng)細(xì)胞 | ? | ? | ? | ? | ? | ? | |
ADCC 和 T 細(xì)胞殺傷形式 | ? | ? | ? | ? | ? | ? | |
即混即讀，無(wú)需清洗 | ? | ? | |||||
384 孔通量 | ? | ? | ? | ? | ? | ? | |
細(xì)胞可用于進(jìn)一步分析 | ? | ||||||
高靈敏度 | ? | ? | ? | ? | ? | ? | |
非放射性 | ? | ? | ? | ? | ? | ? | |
無(wú)需標(biāo)記抗體 | ? | ? | ? | ? |
癌癥免疫療法發(fā)現(xiàn) - Incucyte? 文獻(xiàn)
Griffiths, G.M. et al.?Loss of ARPC1B impairs cytotoxic T lymphocyte maintenance and cytolytic activity. J Clin Invest, 129(12):5600-5614, 2019
- CD8 細(xì)胞毒性 T 淋巴細(xì)胞 (CTL) 依靠分支 F-肌動(dòng)蛋白網(wǎng)絡(luò)的快速重組來(lái)驅(qū)動(dòng)裂解顆粒的極化分泌，從而在適應(yīng)性免疫應(yīng)答期間使靶細(xì)胞開始死亡。Incucyte? 活細(xì)胞分析系統(tǒng)用于監(jiān)測(cè) IL-2 缺乏后較長(zhǎng)時(shí)間范圍內(nèi)靶細(xì)胞的損失
Adams, KJ et al.?The use of induced pluripotent stem (iPS) cells for the safety testing of enhanced affinity TCR-transduced T cells.?Cancer Research, AACR; April 5-9, San Diego, CA, 2014
- 針對(duì)一組代表人體主要器官的 iPS 培養(yǎng)物測(cè)試脫靶 T 細(xì)胞活性。Incucyte? 系統(tǒng)能夠在 4 天內(nèi)直接實(shí)時(shí)觀察 Caspase-3/7 依賴性的細(xì)胞凋亡。
“在 51Cr 釋放甚至 LDH 釋放延長(zhǎng)實(shí)驗(yàn)等短期殺傷實(shí)驗(yàn)中，可能會(huì)遺漏 ImmTAC 的重導(dǎo)向殺傷作用。因此，采用 Incucyte?? 技術(shù)對(duì)于在盡可能嚴(yán)格的條件下評(píng)估 ImmTAC 效力和特異性至關(guān)重要?！?/strong>
Adams, K.?Redirected T cell activity by high affinity TCR-Anti-CD3 Bispecific candidate therapeutics.?PhD?Dissertation,?Cardiff University?(2013)
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產(chǎn)品 | 數(shù)量 | 產(chǎn)品目錄號(hào) |
|---|---|---|
Incucyte? Cell-by-Cell 分析軟件模塊 | 1 個(gè)模塊 | 9600-0031 |
| Incucyte? Caspase-3/7 綠色試劑 | 20?μl | 4440 |
| Incucyte? Caspase-3/7 紅色試劑 | 20?μl | 4704 |
Incucyte? Annexin V 綠色染料 | 1 vial | 4642 |
Incucyte? Annexin V 紅色染料 | 1 vial | 4641 |
Incucyte? Annexin V 橙色染料 | 1 vial | 4759 |
Incucyte? Annexin V NIR 染料 | 1 vial | 4768 |
Incucyte? Nuclight 綠色慢病毒試劑 (bleo) | 0.2 mL | 4626 |
Incucyte? Nuclight 綠色慢病毒試劑 (bleo) | 0.6 mL | 4477 |
Incucyte? Nuclight 紅色慢病毒試劑 (bleo) | 0.2 mL | 4627 |
Incucyte? Nuclight 紅色慢病毒試劑 (bleo) | 0.6 mL | 4478 |
Incucyte? Nuclight 綠色慢病毒試劑 (puro) | 0.2 mL | 4624 |
Incucyte? Nuclight 綠色慢病毒試劑 (puro) | 0.6 mL | 4475 |
Incucyte? Nuclight 紅色慢病毒試劑 (puro) | 0.2 mL | 4625 |
Incucyte? Nuclight 紅色慢病毒試劑 (puro) | 0.6 mL | 4476 |
Incucyte? Nuclight 橙色慢病毒試劑 (puro) | 0.2 mL | 4771 |
Incucyte? Nuclight NIR 慢病毒試劑 (puro) | 0.2 mL | 4805 |
Incucyte? Cytolight 快速綠色試劑 | 1 瓶 (15 μg) | 4705 |
Incucyte? Cytolight 快速紅色試劑 | 5 瓶 × 50 μg | 4706 |
Incucyte? Cytolight 橙色快速染料 | 1 瓶 (1 mg) | 4839 |
Incucyte? 小鼠 IgG2a Fabfluor-488 抗體標(biāo)記試劑 | 1 瓶 (50 μg) | 4743 |
Incucyte? 小鼠 IgG2b Fabfluor-488 抗體標(biāo)記試劑 | 1 瓶 (50 μg) | 4744 |
Incucyte? 小鼠 IgG1 FabFluor-488 抗體標(biāo)記試劑 | 1 瓶 (50 μg) | 4745 |
