1、流式細(xì)胞術(shù)的基本原理

流式細(xì)胞術(shù)（Flow Cytometry）是一種用來分析并測量單個細(xì)胞特征的技術(shù)。流式細(xì)胞儀的工作原理是將經(jīng)過標(biāo)記處理的細(xì)胞樣本在流動系統(tǒng)中以高速通過，同時利用激光束照射細(xì)胞，通過光散射和熒光信號來獲取細(xì)胞的大小、形態(tài)和表面標(biāo)記物等信息。最后，通過數(shù)據(jù)分析和可視化展示，對細(xì)胞進(jìn)行計數(shù)、分類和分析。

流式細(xì)胞儀利用標(biāo)記物的熒光信號來識別和分析細(xì)胞的特征，不僅能夠幫助研究人員了解細(xì)胞表型和功能，還廣泛應(yīng)用于臨床診斷、藥物篩選和疾病研究中。

2、流式細(xì)胞術(shù)的特點(diǎn)

賽多利斯iQue^? 3 采用先進(jìn)的流式細(xì)胞術(shù)平臺，專注于加快整體工作流程，具有以下特點(diǎn)。

• 快速：在整個實(shí)驗(yàn)過程中采用快速的平板取樣、綜合分析和新型數(shù)據(jù)約減工具來突破容量瓶頸，5分鐘即可完成一塊96孔板的檢測與分析。
• 微量化：通過從微量樣本中采樣，最少只需一微升 , 節(jié)約珍貴的樣本和試劑。
• 高內(nèi)涵：同時測量同個孔中的表型和細(xì)胞因子，可生成更多生物相關(guān)數(shù)據(jù)。
• 易用性：利用可易于實(shí)現(xiàn)的自動化功能，可打造簡單、可擴(kuò)展的多用戶環(huán)境，包括 48 小時不間斷運(yùn)行和自動化板載QC微球振蕩；工作流程導(dǎo)向的軟件界面，試劑盒自帶采集和分析模板。
• 洞察力：利用新穎的可視化工具可顯著縮短決策時間，即使是從復(fù)雜的數(shù)據(jù)集中也可以在短時間內(nèi)獲得可操作結(jié)果，可整板顯示直方圖、散點(diǎn)圖和疊加的直方、散點(diǎn)圖，自動計算IC50/EC50。

3、 應(yīng)用

（1）細(xì)胞健康和增殖分析

增殖、細(xì)胞凋亡和細(xì)胞毒性是細(xì)胞健康的重要衡量指標(biāo)，能夠研究藥物、培養(yǎng)條件和基因改造對細(xì)胞生長或活力的影響。

• 細(xì)胞計數(shù)

流式細(xì)胞術(shù)的研究早已不僅局限于定性檢測，更注重定量分析，通過加入熒光參比微球使得流式細(xì)胞儀獲得細(xì)胞絕對計數(shù)的結(jié)果。

iQue^? 細(xì)胞計數(shù)和活力分析試劑盒可在 96 孔和 384 孔板中在寬線性范圍內(nèi)獲得高準(zhǔn)確度，對來自各種非貼壁細(xì)胞系的絕對細(xì)胞計數(shù)和活力數(shù)據(jù)進(jìn)行可重現(xiàn)的分析。該試劑盒可識別活細(xì)胞，免清洗步驟，并且包括經(jīng)過驗(yàn)證的預(yù)設(shè)分析模板，可結(jié)合iQue^??流式細(xì)胞儀快速篩選和分析。

圖1. 對各種比率的生長細(xì)胞與熱滅活細(xì)胞（Jurkat、Raji 或 Ramos 細(xì)胞系）的混合物進(jìn)行測試，以確保整個靈敏度范圍內(nèi)的線性相關(guān)性。

圖2. 模板化圈門和分析

• 細(xì)胞活力

當(dāng)通過流式細(xì)胞術(shù)進(jìn)行細(xì)胞分型時，將死細(xì)胞排除在最終數(shù)據(jù)分析之外，確定細(xì)胞活力十分重要。目前有許多固定活力染色法可用于量化細(xì)胞活力，但是這些方法與固定方案不兼容，最終可能導(dǎo)致在數(shù)據(jù)集中出現(xiàn)偽影。

iQue^? 可固定活力染料是一種區(qū)分活細(xì)胞和死細(xì)胞的氨基活性不透膜染料。染色的細(xì)胞可以固定和透化，使染料與下游細(xì)胞內(nèi)染色相容，并且強(qiáng)度不會有任何減弱。iQue^? 可固定活力分析試劑盒有三種不同顏色可供選擇，可以滿足流式多色 Panel 的需求。

圖3. iQue^? 可固定活力染料染色的 PBMC 的細(xì)胞內(nèi) IFN-γ 表達(dá)檢測和分析實(shí)例。

• 細(xì)胞凋亡

細(xì)胞凋亡是正常組織發(fā)育和內(nèi)穩(wěn)態(tài)的重要過程，細(xì)胞通過該過程適時發(fā)生程序性細(xì)胞死亡。在大多數(shù)情況下，細(xì)胞凋亡的誘導(dǎo)導(dǎo)致線粒體去極化、Caspase 激活和質(zhì)膜改變。同時檢測多種細(xì)胞凋亡標(biāo)志物能夠確認(rèn)細(xì)胞凋亡途徑并深入了解隨時間變化的作用機(jī)制。

圖4. 細(xì)胞凋亡標(biāo)志物：1) 線粒體去極化，2) Caspase 3/7，3) Annexin V，4) 死亡。
iQue^? 人四重細(xì)胞凋亡分析試劑盒不僅可以在單個樣品中同時檢測 Caspase 3/7 活化、Annexin V 結(jié)合、細(xì)胞活性和線粒體去極化（圖 21），還可計算細(xì)胞總數(shù)，以識別劇毒的藥物。根據(jù)實(shí)驗(yàn)?zāi)康?，四種試劑可以同時使用（圖5(A) 和圖5(B)），也可以相互組合使用，無需清洗。細(xì)胞凋亡試劑也可以與其他 iQue^? 試劑聯(lián)合使用實(shí)現(xiàn)多重分析。

圖5. 當(dāng)用誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的藥物處理時，細(xì)胞健康標(biāo)志物表現(xiàn)出時間依賴性增加。

將 Jurkat 細(xì)胞 (1e6 個細(xì)胞/mL) 用各種濃度的星形孢菌素進(jìn)行處理。在使用 3 種細(xì)胞凋亡試劑處理 2 h、6 h 和 24 h 后，取 20 μL 樣品進(jìn)行分析。(A) 在 2 h 時半胱天冬酶陽性細(xì)胞百分比 (%) 的熱圖，(B) 線粒體去極化，(C) Caspase，(D) Annexin V。

（2）免疫細(xì)胞功能分析

免疫細(xì)胞根據(jù)其周圍環(huán)境具有不同而復(fù)雜的反應(yīng)和功能。根據(jù)這些混合表型的細(xì)胞表面標(biāo)記表達(dá)和/或分泌的可溶性介質(zhì)來鑒定免疫細(xì)胞對于發(fā)現(xiàn)新治療方法至關(guān)重要。

• T細(xì)胞活化

抗原和共刺激信號對初始T細(xì)胞的活化啟動了CD4+輔助T細(xì)胞和CD8+細(xì)胞毒性T細(xì)胞的克隆擴(kuò)增。T細(xì)胞活化分析的監(jiān)測和定量能夠幫助我們更好地理解T細(xì)胞如何對某些刺激作出響應(yīng)。

圖6. iQue^?人T細(xì)胞活化分析試劑盒的分析原理示意圖。

不同T細(xì)胞表型分析主要通過檢測3個活化標(biāo)志物的表達(dá)：CD69（早期）、CD25（晚期）和 HLA-DR（更晚期）。還可以使用2-plex Qbeads，通過夾心法免疫分析，在同一孔中定量分析 2 種效應(yīng)細(xì)胞因子（IFNγ 和 TNFα）。

圖7. 通過T細(xì)胞活化分析試劑盒進(jìn)行T細(xì)胞表型和細(xì)胞因子釋放分析。

• T細(xì)胞殺傷

細(xì)胞毒性 T 淋巴細(xì)胞 (CTL)是免疫系統(tǒng)的功能性 (CD8+) 細(xì)胞亞群，可釋放穿孔素，在靶細(xì)胞膜上形成孔洞，顆粒酶通過這些孔洞進(jìn)入細(xì)胞，誘導(dǎo)靶細(xì)胞凋亡。

圖8. iQue^? 人 T 細(xì)胞殺傷分析試劑盒的分析原理示意圖。

通過 CD8+ T 細(xì)胞的狀態(tài)分析，可檢測活化標(biāo)志物 CD25 和耗竭標(biāo)志物 PD-1，還可以使用 2-plex Qbeads，通過夾心法免疫分析，在同一孔中定量分析 2 種效應(yīng)細(xì)胞因子（IFNγ 和顆粒酶 B）。

圖9. 通過 iQue^? 人 T 細(xì)胞殺傷分析試劑盒進(jìn)行 T 細(xì)胞表型和細(xì)胞因子釋放分析。

• NK細(xì)胞殺傷

評估NK細(xì)胞介導(dǎo)新療法的關(guān)鍵過程之一是定量分析NK細(xì)胞活化和腫瘤殺傷能力，以深入洞察潛在的療效。

圖10. iQue^? 人NK細(xì)胞殺傷分析試劑盒的分析原理圖解。

iQue^? 能夠在一個孔中同時進(jìn)行靶細(xì)胞識別、細(xì)胞健康、細(xì)胞功能、免疫分型和細(xì)胞因子分析。靶細(xì)胞通過熒光編碼染料染色與效應(yīng)細(xì)胞區(qū)分開來，然后通過熒光細(xì)胞膜完整性染料進(jìn)行染色，檢測腫瘤細(xì)胞殺傷效果。使用 CD3、CD56 和 CD16 識別 NK 細(xì)胞，使用 CD69 和 CD25 評估細(xì)胞的活化狀態(tài)。在同一孔中，使用 2種 iQue^? Qbeads^?，通過夾心法免疫分析對促炎細(xì)胞因子干擾素 γ (IFNγ) 和促凋亡絲氨酸蛋白酶 - 顆粒酶 B 的產(chǎn)生進(jìn)行定量分析。還可以使用人 NK 細(xì)胞配套試劑盒分析其他細(xì)胞因子。搭配iQue^? 人NK 細(xì)胞配套試劑盒，還可以檢測6 種額外的人細(xì)胞因子和效應(yīng)蛋白。

• T細(xì)胞記憶

疫苗和過繼性細(xì)胞轉(zhuǎn)化免疫治療方案都會受記憶T細(xì)胞異質(zhì)性的影響，能夠使用單個方法鑒別這些功能不同的記憶T細(xì)胞亞群對于免疫治療具有重要意義。

圖11. iQue^? 人T細(xì)胞記憶分析試劑盒的分析原理示意圖。在單個孔中同時測量活化標(biāo)志、細(xì)胞增殖和細(xì)胞因子。

通過 CD3、CD4 和 CD8 標(biāo)志物的染色檢測 T 細(xì)胞的基本表型。通過 CD45RA、CD45RO、CD27、CD62L 和 CD95 標(biāo)志物的染色檢測 T 細(xì)胞活化后不同分化階段的 T 細(xì)胞亞型（TN、TSCM、TCM、TTM、TEM、TEMRA 和 TTE）。在同一個孔中，還可以通過夾心法免疫分析，使用 Qbeads 定量分泌的促炎細(xì)胞因子 IFNγ 和抗炎細(xì)胞因子 IL-10。使用膜完整性熒光染料進(jìn)行染色，區(qū)分活免疫細(xì)胞與死細(xì)胞。

• T細(xì)胞耗竭

T細(xì)胞耗竭是指長期刺激造成的 T 細(xì)胞功能障礙。耗竭性t細(xì)胞可表現(xiàn)出獨(dú)特的表型，包括抑制性標(biāo)志物（例如 PD-1、LAG-3 和 TIM-3）過度表達(dá)，以及 T 細(xì)胞釋放促炎性細(xì)胞因子（IFNγ 和 TNFα）的能力減弱。

圖12. iQue^? 人 T 細(xì)胞耗竭分析試劑盒的分析原理示意圖。

T 細(xì)胞表型分析主要通過檢測 3 個耗竭標(biāo)志物的表達(dá)：PD-1（早期）、LAG-3（中期）和 TIM-3（晚期）。還可以使用 2-plex Qbeads，通過夾心法免疫分析，在同一孔中定量分析 2 種效應(yīng)細(xì)胞因子（IFNg 和 TNFα）。

• TIL和MLR

以溫和方式分離 3D 腫瘤模型，從而對 T 細(xì)胞浸潤進(jìn)行定量分析：

圖13. 使用 iQue^? 高通量流式細(xì)胞儀平臺對腫瘤浸潤淋巴細(xì)胞（TIL）進(jìn)行體外分析的方案示意圖。

MLR通過將來自兩個個體的免疫細(xì)胞進(jìn)行共培養(yǎng)，以觸發(fā)免疫檢查點(diǎn)調(diào)控所需的“非自體”識別：

圖14. 混合淋巴細(xì)胞反應(yīng) (MLR) 的分析原理示意圖

對T細(xì)胞表型和功能的全面評估對于理解T 細(xì)胞生物學(xué)和建立更好的治療方法至關(guān)重要。iQue^??高通量流式細(xì)胞儀搭配基于免疫細(xì)胞和微球的試劑盒為免疫細(xì)胞功能表征提供全新解決方案。智能Forecyt^??軟件自動生成直方圖、劑量反應(yīng)曲線以及整板可視化數(shù)據(jù)結(jié)果，簡化流式分析，提供更多見解。

（3）抗體表征

• 抗體依賴性細(xì)胞吞噬作用 (ADCP)

抗體依賴性細(xì)胞吞噬作用 (ADCP) 是一種免疫消除機(jī)制，其憑借單克隆抗體(mAb) 靶向腫瘤細(xì)胞，以促進(jìn)吞噬免疫細(xì)胞將腫瘤細(xì)胞從體內(nèi)清除。

iQue^? 的 ADCP 利用 iQue^? 人抗體依賴性細(xì)胞吞噬作用試劑盒，通過精簡的工作流程對活靶細(xì)胞與 CD14+ 原代效應(yīng)細(xì)胞的共定位進(jìn)行定量，實(shí)現(xiàn) ADCP 的高通量測定。

圖15. iQue^? 人抗體依賴性細(xì)胞吞噬作用試劑盒分析原理示意圖。

在 96 孔板或 384 孔板中，將 iQue^? 增殖和編碼（B/綠色）染料標(biāo)記的靶細(xì)胞與測試抗體共孵育，然后加入未標(biāo)記的效應(yīng)細(xì)胞（PBMC 或富集的單核細(xì)胞或巨噬細(xì)胞群）。

使用 iQue^? 細(xì)胞膜完整性（R/紅色）染料分離活細(xì)胞與死細(xì)胞。將根據(jù)靶細(xì)胞編碼器呈陽性的活的 CD14+ 效應(yīng)細(xì)胞的百分比對 ADCP 進(jìn)行定量。

圖16. 簡便的 iQue^? 人抗體依賴性細(xì)胞吞噬作用試劑盒實(shí)驗(yàn)方案。

• 抗體內(nèi)化

細(xì)胞表面抗原特異性的抗體會誘導(dǎo)內(nèi)吞作用，從而導(dǎo)致這些抗體以及與其結(jié)合的任何分子一起被細(xì)胞內(nèi)化，這一過程被稱為抗體內(nèi)化（ABI），在研究和臨床發(fā)現(xiàn)方面具有許多強(qiáng)大的應(yīng)用。

圖17. pH 敏感熒光探針原理。

iQue^??抗體內(nèi)化試劑盒提供一種新型 pH 敏感熒光探針能夠在完整的含血清培養(yǎng)基中快速、無需洗滌地標(biāo)記同種型匹配的抗體。當(dāng)內(nèi)化抗體被加工到酸性內(nèi)體和溶酶體途徑時，會產(chǎn)生熒光信號。抗體內(nèi)化被量化為熒光探針呈陽性的活細(xì)胞的百分比。使用隨附的 iQue^??細(xì)胞膜完整性染料可以同時測量細(xì)胞活力。

圖18. iQue^??抗體內(nèi)化試劑盒示意圖。

• 抗體結(jié)合分析

iQue^??抗體結(jié)合測定和工作流程可以幫助識別和表征抗體與靶點(diǎn)的結(jié)合。我們提供兩種檢測方法：第一種是直接抗體結(jié)合測定，可以根據(jù)與靶細(xì)胞的結(jié)合對 mAb 進(jìn)行排序，并能夠在單個孔中分析與多種細(xì)胞類型的結(jié)合。第二種是競爭性結(jié)合測定，可以揭示針對不同表位的單克隆抗體。

圖19. 直接抗體結(jié)合測定工作流程。

圖20. 競爭抗體結(jié)合測定工作流程。

• 補(bǔ)體依賴細(xì)胞毒性分析

抗體療法的三個關(guān)鍵 Fc 介導(dǎo)功能是抗體依賴性細(xì)胞毒性 (ADCC)、抗體依賴性細(xì)胞吞噬作用 (ADCP) 和補(bǔ)體依賴性細(xì)胞毒性 (CDC)。在 單克隆抗體（mAb） 開發(fā)過程中，必須分析新型 mAb候選物的 CDC 活性，以全面了解其 Fc 介導(dǎo)的抗腫瘤功能。

圖21. 使用高通量流式細(xì)胞術(shù)進(jìn)行 CDC 測定的工作流程示意圖

我們提出了一種簡單、簡化的檢測方法，使用 iQue^??高級流式細(xì)胞術(shù)平臺測量單克隆抗體針對活靶細(xì)胞的 CDC 活性。在人血清存在的情況下用感興趣的單克隆抗體培養(yǎng)靶細(xì)胞，其中含有啟動補(bǔ)體級聯(lián)以及隨后在細(xì)胞上形成膜攻擊復(fù)合物所需的蛋白質(zhì)。使用 iQue^??細(xì)胞膜完整性（R/紅色）染料標(biāo)記細(xì)胞，以定量細(xì)胞死亡作為 CDC 活性的指標(biāo)。

（4）基于微球的多細(xì)胞因子分析

生物學(xué)相關(guān)分泌蛋白和細(xì)胞因子的定量在基礎(chǔ)研究和藥物開發(fā)中至關(guān)重要，對于理解炎癥和腫瘤學(xué)中的 T 細(xì)胞活化和細(xì)胞信號級聯(lián)放大作用等都有極大幫助。

借助豐富的 iQue^? Qbeads^? Plexscreen 的系列試劑，研究人員可通過不同類型的微球捕獲來分析分泌蛋白，從而實(shí)現(xiàn)生物參數(shù)的多重定量。用戶可以將 iQue^? Qbeads^? 檢測與其他 iQue^? 分析試劑盒結(jié)合使用，通過簡化的無縫工作流程，對蛋白質(zhì)分泌、細(xì)胞活力、標(biāo)志物表達(dá)和增殖進(jìn)行高通量測量。

圖22. 使用 iQue^? Forecyt^? 軟件系統(tǒng)快速方便地分析數(shù)據(jù)。

圖23. 分泌信號分子和細(xì)胞功能的多重定量。

（5）其他

• iPSC誘導(dǎo)多能干細(xì)胞分析

2020年時，阿斯利康改良Crisper-cas9技術(shù)，開發(fā)了一種ObLiGaRe強(qiáng)力霉素誘導(dǎo)型SpCas9(ODInCas9)轉(zhuǎn)基因小鼠模型，靶向ObLiGaRe導(dǎo)致人類或小鼠細(xì)胞的功能整合，最終產(chǎn)生ODInCas9小鼠，并且驗(yàn)證發(fā)現(xiàn)這種小鼠體細(xì)胞體內(nèi)編輯可以模擬非小細(xì)胞肺癌 (NSCLC) 腺癌，使治療研究能夠驗(yàn)證候選藥物的功效。在判斷基因編輯成功與否時，應(yīng)用到Incucyte^? 檢測細(xì)胞增殖，并聯(lián)合使用iQue^? 及Incucyte^? 篩選GFP陽性的細(xì)胞。

圖24. 高通量篩選編輯成功的GFP陽性細(xì)胞。

將各種不同組織細(xì)胞以及iPSC細(xì)胞導(dǎo)入OdInCas9，抗生素篩選后進(jìn)行單克隆挑選培養(yǎng)，用Incucyte^? 拍照成像，識別GFP陽性細(xì)胞，為確定是否真正導(dǎo)入OdInCas9，加入Dox誘導(dǎo)GFP表達(dá)，細(xì)胞消化后放入96孔板，用我們的iQue^? 鑒別GFP陽性細(xì)胞。