支原體是最小的自由生存生物。它們屬于細菌類柔膜細菌目，其特征在于無細胞壁。因此，它們不受許多常用抗菌劑的影響。支原體是細胞培養(yǎng)中廣泛存在的污染物。由于支原體非常微小（約 0.3 - 0.8μm），無法用光學顯微鏡觀察到支原體污染，受感染細胞培養(yǎng)物中的生長率和形態(tài)的改變會很小且不明顯。但是受支原體污染的產(chǎn)品會造成人類健康風險。所有這些都清楚地表明了對支原體常規(guī)檢測的高需求。

賽多利斯Microsart^? ATMP支原體檢測試劑盒能夠根據(jù)《歐洲藥典》2.6.7可靠、靈敏地檢測細胞培養(yǎng)中和細胞培養(yǎng)衍生生物制品中的支原體DNA。

在本研究中，通過使用賽多利斯的定量CFU和GC標準，對9種不同種類支原體基因組拷貝（GC）和菌落數(shù)（CFU）之間的相關性進行了研究。由于PCR技術僅檢測基因組拷貝（GC），而不同的監(jiān)管部門，如韓國食品和藥品監(jiān)督管理局（KFDA）和日本藥品和醫(yī)療器械管理局（PMDA）要求在通過細胞培養(yǎng)產(chǎn)品質(zhì)量控制所用的檢測前要提供菌落數(shù)（CFU）與基因組拷貝（GC）的相關性。本研究的結果表明，盡管不同種類支原體間的基因組拷貝數(shù)不同，但都成功關聯(lián)了20 CFU或是40 CFU的比例相關性。

材料和方法

Microsart^? 支原體驗證標準品的DNA提取

Microsart^? 支原體驗證標準品的每一包裝包含3個小瓶，每個小瓶包含 10 CFU 所選支原體種類。將 250μl 杜氏最低營養(yǎng)必需培養(yǎng)基（DMEM）+10%胎牛血清（FBS）加到兩個小瓶中，以制備一份濃度為 40 CFU/ml的懸浮液。將 500 μl DMEM +10%FBS加到一個小瓶中，以制備一份濃度為 20 CFU/ml的懸浮液。根據(jù)方案用Microsart^? AMP 提取試劑盒平行提取各細胞懸浮液的DNA。洗脫液直接用于Microsart^? ATMP 支原體qPCR 試劑盒檢測。

Microsart^? 校準試劑標準曲線

表1：針對不同種類支原體的Microsart^? 支原體驗證標準品和Microsart^? 校準試劑的產(chǎn)品概述。

為了量化Microsart^? 支原體驗證標準品的 DNA 提取物，有必要使用已知濃度的基因組拷貝（GC）建立一條標準曲線。因此，使用了Microsart^? 校準試劑。校準試劑再水合后含特定細菌10? GC/μl 。在 Tris 緩沖液中制備稀釋梯度系列樣品，以使最終濃度達到5 GC/10μl 至 500 GC/10μl。

Microsart^? ATMP 支原體qPCR 試劑盒

對試劑盒里所有凍干組分再水化。針對一次反應，將 15μl 的支原體混合物與 1μl 的內(nèi)標對照 DNA 混合。將 15μl 該混合物加至每個 PCR 管中。每次至少使用兩個無模板對照（NTC）進行檢測，并且平行取樣兩份。因此，將 10μl 的樣本或 NTC 分別加至帶有反應混合物的 PCR 管中。

在熒光定量 PCR 儀 CFX96 Touch Cycler（Bio-Rad；45 個周期，3min 95 ℃，30s 95 °，30s 55 ℃，45s 60 ℃）上進行Microsart^? ATMP 支原體 qPCR 檢測。支原體DNA由一條FAM? 熒光通道中的增強熒光信號表示。在同一試管中的 ROX? 通道中檢測到內(nèi)標對照DNA，該試劑盒用 FAM? 和 ROX? 雙探針來指示 PCR 檢測系統(tǒng)的正常無抑制。使用CFX Manager Software（Bio-Rad）進行反應分析。《歐洲藥典》/《美國藥典》中列出的所有支原體種類的檢測限為≤10cfu/ml。

結果

圖2和3顯示了萊氏衣原體的示例性擴增圖?；赾t值（FAM?通道）和標準濃度，CFX Manager軟件使用一個線性方程創(chuàng)建了一條標準曲線（圖1）?；貧w系數(shù)0.983表明標準曲線良好。最優(yōu) qPCR 的效率為100%。在這種情況下，擴增子 DNA 將在每個周期內(nèi)翻倍。根據(jù)對 CFX 軟件的分析，萊氏衣原體的示例性 qPCR 運行以101%的效率高效運行（參見圖1中的效率）。

圖1：使用Microsart^? ATMP支原體試劑盒產(chǎn)生的最終基因組拷貝（GC）濃度5 GC/10μl至500 GC/10μl的萊氏無膽甾原體（Microsart^? 校準試劑）的示例性標準曲線。

每個樣本和無模板對照（NTC）都顯示了內(nèi)標對照DNA的一個擴增，因此也造成了ROX?通道中的熒光信號（Ct<40；數(shù)據(jù)未示出）。表明了PCR檢測成功且無抑制。如預期，NTC在FAM?通道中未顯示熒光信號（參見圖2和圖3）。因此，表明了 PCR 反應的無支原體制備無交叉感染。

圖2：Microsart^? ATMP支原體qPCR試劑盒生成的萊氏無膽甾原體的示例性擴增圖。

圖3：Microsart^? ATMP支原體qPCR試劑盒生成的萊氏無膽甾原體的示例性擴增圖。

已在所有樣本中成功檢測到20 CFU/ml 和40 CFU/ml 的每種支原體（測定LOD≤10cfu/ml；在試劑盒驗證期間確定）。

基于標準曲線的線性方程，軟件計算的支原體樣本GC濃度（20CFU/ml 和 40CFU/ml 提取物）。9 種不同種類支原體的平均GC/CFU比率如表2所示。

表2： 9種不同種類支原體的平均GC/CFU率

討論

在本研究中，使用賽多利斯定量 GC 和 CFU 標準研究了 9 種不同種類支原體的基因組拷貝（GC）和菌落數(shù)（CFU）之間的相關性。研究結果表明：GC 值高于 CFU 值。理論 GC:CFU 比率應為1:1，因為理想情況下，每個細胞應檢測一個GC。實際上，即使在早期指數(shù)增生期就收獲支原體培養(yǎng)物，以防止在制劑中檢測到死細胞DNA，該比率也是不可實現(xiàn)的。出現(xiàn)非等比是因為大量的支原體細胞不會在培養(yǎng)基中生長成菌落并不被檢測到（即，活的但非可培養(yǎng)的細胞）。此外，支原體細胞易于形成團聚體，會被檢測為1個CFU，但實際上它結合了多個細胞，因此是好幾個GC。

這兩種情況都會嚴重低估細胞培養(yǎng)樣本中的真實支原體細胞數(shù)，因為只有一部分細胞會生長為一個CFU。使用基于生長的方法，不可培養(yǎng)的物種或可生存但不可培養(yǎng)的細胞可能導致假陰性的結果。由于基于生長的方法中的假陰性結果而未檢測到支原體污染可能會產(chǎn)生具有潛在感染風險的不安全產(chǎn)品，特別是對于免疫缺陷的患者，這種風險會更嚴重。

總結

本研究表明：GC 和 CFU 之間的相關性可以成功地被證明，并且在驗證期間易于實施證明試驗。另外，可以通過 PCR 的 GC 檢測顯示各樣本中實際污染水平的一個更真實結果，因此直接有利于藥物安全。

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