誘導(dǎo)多能干細(xì)胞（iPSC，簡(jiǎn)稱(chēng)為iPS細(xì)胞），是一種由哺乳動(dòng)物成體細(xì)胞經(jīng)轉(zhuǎn)入轉(zhuǎn)錄因子等手段脫分化形成的多能干細(xì)胞，最早由日本學(xué)者山中伸彌的研究團(tuán)隊(duì)于2006年發(fā)現(xiàn)。作為研究發(fā)育或疾病分子機(jī)制的理想研究工具，識(shí)別新治療靶點(diǎn)和高通量藥物篩選方面的廣闊應(yīng)用[1]。

雖然iPSC研究已經(jīng)取得長(zhǎng)足進(jìn)步，但在后續(xù)的研究過(guò)程中，仍存在一些挑戰(zhàn)。誘導(dǎo)iPSC生成的過(guò)程中，效率低、致瘤性、外源基因插入等問(wèn)題仍然存在，iPSC誘導(dǎo)向人體組織細(xì)胞的過(guò)程中也存在成熟度不足、致瘤性風(fēng)險(xiǎn)等問(wèn)題，需要培養(yǎng)方法的優(yōu)化以及對(duì)重編程分子機(jī)制的進(jìn)一步研究。要解決這一系列問(wèn)題，必須通過(guò)高通量的研究發(fā)現(xiàn)新的靶點(diǎn)和培養(yǎng)及誘導(dǎo)方法，Incucyte^? 實(shí)時(shí)活細(xì)胞分析系統(tǒng)和iQue^? 高通量流式細(xì)胞儀可以滿(mǎn)足高通量研究的需求，為iPSC研究插上騰飛的翅膀。

Incucyte^? 在iPSC研究中的應(yīng)用

工欲善其事，必先利其器。在iPSC的研究過(guò)程中，在不挪動(dòng)細(xì)胞的前提下，Incucyte^? 可以實(shí)現(xiàn)長(zhǎng)時(shí)間實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)iPSC向特定細(xì)胞類(lèi)型分化的整個(gè)分化過(guò)程中細(xì)胞特征的變化，包括細(xì)胞形態(tài)、增殖、凋亡等指標(biāo)，并且一次可放6塊培養(yǎng)板，滿(mǎn)足高通量活細(xì)胞成像的要求。

iPSC研究大致有兩個(gè)方向：

1. 優(yōu)化培養(yǎng)條件、誘導(dǎo)體系等以期獲得更穩(wěn)定的iPSC細(xì)胞系；iPSC細(xì)胞呈現(xiàn)克隆生長(zhǎng)，為確定不同iPSC細(xì)胞系，哪種在后續(xù)基因編輯以及誘導(dǎo)中更加穩(wěn)定，對(duì)各個(gè)細(xì)胞系實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)，通過(guò)匯合度計(jì)算增殖情況[7]。

圖1. 候選細(xì)胞系的增殖特征：

A：Incucyte^? 記錄不同iPSC細(xì)胞系傳代三天后的圖片；B：3×10^4?個(gè)細(xì)胞接種48h細(xì)胞消化計(jì)數(shù)；C：使用Incucyte^? 計(jì)算3個(gè)時(shí)間點(diǎn)匯合度（confluence）來(lái)評(píng)估iPSC增殖情況

2. 模擬疾病模型以及分化出更成熟的成體組織細(xì)胞，包括優(yōu)化誘導(dǎo)條件以及改為3D培養(yǎng)等。下面兩篇文獻(xiàn)的Figure展示了向神經(jīng)以及心肌細(xì)胞方向的分化：

圖2. 體外培養(yǎng)20天的分化神經(jīng)熒光細(xì)胞簇：

在iPSC向神經(jīng)細(xì)胞分化的過(guò)程中，用βIII-tubulin (TUJ1) 對(duì)未成熟神經(jīng)元的聚集體進(jìn)行染色，并顯示從(a)陰性對(duì)照聚集體、(b)未加載的微球結(jié)合聚集體、(c)微球結(jié)合聚集體和(d)陽(yáng)性對(duì)照聚集體[8]。Incucyte^? 自動(dòng)拍攝36張單獨(dú)圖像組合而成，用 ImageJ 軟件拼接和裁剪。比例尺：300 μm。

圖3. hiPSC-CM 實(shí)時(shí)凋亡信號(hào)檢測(cè)

心肌分化，作者利用一種新的Metabolic Selected的誘導(dǎo)選擇方法制備缺血性心肌病模型的心肌細(xì)胞，這種模型的心肌細(xì)胞應(yīng)具備Dox毒性敏感特征。利用我們的活細(xì)胞凋亡指示劑^[9]實(shí)時(shí)檢測(cè)在加入Dox后心肌細(xì)胞的死亡情況發(fā)現(xiàn)Annexin V+的細(xì)胞比例隨Dox濃度提升死亡比例上升。

iQue^? 在iPSC研究中的應(yīng)用

除Incucyte^? 的應(yīng)用外，高通量的研究當(dāng)然少不了我們的iQue^? 高通量流式細(xì)胞儀，專(zhuān)為大規(guī)模篩選設(shè)計(jì)。

2020年時(shí)，阿斯利康改良Crisper-cas9技術(shù)，開(kāi)發(fā)了一種ObLiGaRe強(qiáng)力霉素誘導(dǎo)型SpCas9(ODInCas9)轉(zhuǎn)基因小鼠模型，靶向ObLiGaRe導(dǎo)致人類(lèi)或小鼠細(xì)胞的功能整合，最終產(chǎn)生ODInCas9小鼠，并且驗(yàn)證發(fā)現(xiàn)這種小鼠體細(xì)胞體內(nèi)編輯可以模擬非小細(xì)胞肺癌 (NSCLC) 腺癌，使治療研究能夠驗(yàn)證候選藥物的功效。在判斷基因編輯成功與否時(shí)，應(yīng)用到Incucyte^? 檢測(cè)細(xì)胞增殖，并聯(lián)合使用iQue^? 及Incucyte^? 篩選GFP陽(yáng)性的細(xì)胞[10]。

圖4. 高通量篩選編輯成功的GFP陽(yáng)性細(xì)胞：

將各種不同組織細(xì)胞以及iPSC細(xì)胞導(dǎo)入OdInCas9，抗生素篩選后進(jìn)行單克隆挑選培養(yǎng)，用Incucyte^? 拍照成像，識(shí)別GFP陽(yáng)性細(xì)胞，為確定是否真正導(dǎo)入OdInCas9，加入Dox誘導(dǎo)GFP表達(dá)，細(xì)胞消化后放入96孔板，用我們的iQue^? 鑒別GFP陽(yáng)性細(xì)胞。

除此之外， 賽多利斯對(duì)兩者在iPSC中的應(yīng)用做了一個(gè)簡(jiǎn)單的示例（圖5）：

圖5. iPSC檢測(cè)實(shí)驗(yàn)流程：

1. 多能性檢測(cè)：iQue^? 檢測(cè)iPSC細(xì)胞系多能性標(biāo)記基因表達(dá)并用Incucyte^? 檢測(cè)細(xì)胞形態(tài)；
2. 2D培養(yǎng)時(shí)，利用Incucyte^? 拍照，iQue^? 檢測(cè)表面標(biāo)記基因表達(dá)；
3. 3D培養(yǎng)21天后，以同樣方法檢測(cè)。

而下圖就是一個(gè)很好的案例。

圖6. 優(yōu)化培養(yǎng)基長(zhǎng)期培養(yǎng)特征評(píng)估：

我們加入一種基礎(chǔ)培養(yǎng)基以及一種優(yōu)化培養(yǎng)基培養(yǎng)ATCC-DYS0100 iPSC細(xì)胞系，并檢測(cè)這兩種情況下的生長(zhǎng)狀況、形態(tài)以及標(biāo)記基因表達(dá)（圖5），可以看到陰性對(duì)照（非多能細(xì)胞）THP1細(xì)胞表達(dá)高水平SSEA-1，低表達(dá)TRA-1-60，陽(yáng)性對(duì)照NCCIT細(xì)胞恰恰相反（圖6 A），優(yōu)化過(guò)培養(yǎng)基在長(zhǎng)期培養(yǎng)到18天時(shí)，仍然保持著很強(qiáng)的多能性，而非優(yōu)化培養(yǎng)基隨著時(shí)間推移，逐漸分化。Forecyt分析軟件特有的熱圖結(jié)果，清晰地展示18天時(shí)多能性標(biāo)記基因的表達(dá)比例（圖6 B），從而方便地實(shí)現(xiàn)大規(guī)模篩選。Incucyte^? 對(duì)培養(yǎng)的擬胚體進(jìn)行觀察，發(fā)現(xiàn)優(yōu)化過(guò)的細(xì)胞偏心度遠(yuǎn)低于未優(yōu)化組，更加圓潤(rùn)（圖6 C,D），證明優(yōu)化過(guò)的培養(yǎng)基對(duì)于多能性的維持作用明顯。

展望未來(lái)，利用iPSC這種理想研究工具，可從成千上萬(wàn)種的藥物中，發(fā)現(xiàn)藥物的新靶點(diǎn)、新作用，乃至發(fā)現(xiàn)新的藥物，誘導(dǎo)出真正替代人體成體細(xì)胞成熟度的細(xì)胞。

為什么要用Incucyte^? 長(zhǎng)時(shí)程細(xì)胞影像分析系統(tǒng)？

• iPSC異質(zhì)性強(qiáng)對(duì)培養(yǎng)條件要求苛刻，培養(yǎng)箱內(nèi)可長(zhǎng)達(dá)數(shù)周的連續(xù)觀察，最短幾分鐘間隔拍攝，減少人力，防止過(guò)多操作對(duì)細(xì)胞的傷害

• 6個(gè)板位，分別獨(dú)立設(shè)置檢測(cè)程序，可以兼容各種孔板和培養(yǎng)皿，通量高

• 高效簡(jiǎn)便的模塊化軟件設(shè)置和數(shù)據(jù)分析，輸出圖片、視頻、生長(zhǎng)曲線(xiàn)等多指標(biāo)多參數(shù)；本文提到了使用Incucyte^? 多個(gè)參數(shù)的調(diào)節(jié)，使得結(jié)果更加準(zhǔn)確

• 大于100種優(yōu)化過(guò)的活細(xì)胞專(zhuān)用熒光試劑、耗材及詳盡的Protocol；文章數(shù)大于12000篇，是長(zhǎng)時(shí)間活細(xì)胞成像產(chǎn)品中最多

為什么要用iQue^? 高通量流式呢？

• 氣泡分隔的連續(xù)采樣技術(shù)，使流式細(xì)胞術(shù)進(jìn)入高通量篩選(HTS)領(lǐng)域
• 最小樣本體積達(dá)到10uL，支持384、1536孔板采樣，96孔板只需5min
• ForeCyt軟件、比起傳統(tǒng)流式更簡(jiǎn)單的使用及維護(hù)，硬件配套軟件，是高通量流式篩選必備儀器。雖然在文章中未提及iQue^? 的高通量應(yīng)用