細胞表面糖基化是腫瘤轉為惡性癌癥的一個標志。特定蛋白質的糖基化會影響其結構穩(wěn)定性和表達水平。細胞表面蛋白或脂質的唾液酸聚糖化通過多種機制抑制免疫激活并充當糖免疫檢查點。其中唾液酸聚糖與唾液酸結合性免疫球蛋白樣凝集素Siglec（sialic acid-binding immunoglobulin-like lectin）的相互作用，近期引起了科學家們的廣泛關注。

Carolyn R. Bertozzi和K. Barry Sharpless獲得了2022年諾貝爾化學獎，以表彰他們在發(fā)展點擊化學和生物正交化學方面的貢獻。他們利用點擊化學開發(fā)了一些針對糖基化的靶向藥物，在研究中他們都用了活細胞實時成像系統(tǒng)Incucyte^?！

2022年諾貝爾化學獎Carolyn R. Bertozzi

靶向降解唾液酸聚糖^【1】

抑制型Siglec與PD-1類似，其胞內端含有免疫受體酪氨酸抑制結構域（ITIM），能夠募集磷酸水解酶SHP1/2。研究表明，腫瘤細胞表面蛋白或脂質的唾液酸聚糖化通過唾液酸聚糖與Siglec信號通路發(fā)揮免疫抑制功能，而唾液酸酶可以清除這些唾液酸聚糖?；诖?，研究者利用生物正交反應構建了以腫瘤特異性的方式靶向降解唾液酸聚糖的生物制品——曲妥珠單抗（靶向HER2陽性腫瘤）-唾液酸酶偶聯(lián)物T-Sia 2（下圖d）。T-Sia 2抑制腫瘤生長，增強免疫細胞浸潤，并延長曲妥珠單抗抵抗小鼠的生存周期。

文章使用Incucyte^? 檢測曲妥珠單抗與唾液酸酶之間連接子（Linker）的穩(wěn)定性。研究者將熒光素AF647標記連接子（oxime和HIPS）-抗體的偶聯(lián)物（下圖a），加入到HER2陽性的細胞培養(yǎng)體系里，并在培養(yǎng)箱內進行連續(xù)4天的實時成像。通過檢測并定量細胞上偶聯(lián)物的總熒光強度隨時間的改變，定量結果可以體現(xiàn)該偶聯(lián)物隨時間的內化、降解（圖c）和長時程穩(wěn)定性（圖d和e）。結果發(fā)現(xiàn)HIPS-曲妥珠單抗偶聯(lián)物更穩(wěn)定。

a. AF647標記兩種連接子-抗體的偶聯(lián)物，與人血漿在37度孵育兩天后trastuzumab-HIPS的水平更高，與HCC-1954細胞孵育1h后，換成正常培養(yǎng)基，trastuzumab-HIPS內化幅度更高，之后均被酶解隨時間熒光信號降低（圖c），如在培養(yǎng)基內加入蛋白酶抑制劑來抑制酶解，trastuzumab-HIPS信號可以保持長時程穩(wěn)定（圖d），如孵育后固定兩種耦聯(lián)物信號均可保持長時程穩(wěn)定（圖e）。

Incucyte^? 成像組件就置于培養(yǎng)箱內，想拍攝多久就拍攝多久。

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2022年諾貝爾化學獎K. Barry Sharpless

靶向降解Siglec-7/9^【2】

Siglec-7/9在腫瘤浸潤的髓系細胞上表達水平很高，雖然T細胞內Siglec的轉錄本只是基礎水平，但它可以從腫瘤微環(huán)境內發(fā)生相互作用的髓系細胞上通過胞吞作用獲取Siglec-7/9。后者使T細胞受體TCR相關信號通路去磷酸化，從而抑制T細胞功能。使用氟化硫交換（SuFEx）點擊化學，研究者開發(fā)了可以與Siglec-7/9以高特異性、高親和力結合的配體，并在該配體的基礎上構建了Siglec-7/9 的降解劑——Sig7/9de。該降解劑借助細胞膜上的甘露糖-6-磷酸受體（M6PR）將Sigle內化到溶酶體內，以不可再循環(huán)的方式被降解（下圖g）。Western Blot和流式檢測結果表明Sig7/9de可以誘導T細胞和髓系細胞膜上Siglec高效的降解。

野生型（EV P14）T細胞對B16-GP33腫瘤細胞具有顯著的殺傷作用，Siglec-7/9均高表達T細胞（Siglec-7/9+ P14）的殺傷作用減弱，如在殺傷體系中加入Sig7/9de，其對腫瘤細胞的殺傷能力恢復（下圖h）。

g. Sig7/9de降解試劑作用模式圖；h. B16-GP33腫瘤細胞表達GFP，加入不同處理的P14 T細胞，利用Incucyte^? 間隔3h實時成像檢測48h，以各組GFP陽性靶細胞數(shù)量與單靶細胞組細胞數(shù)的比值來定量各時間點T細胞的殺傷作用。

實時定量曲線直觀顯示效應細胞什么時間點開始殺傷靶細胞，以及各組T細胞殺傷速度和強度的差異，定量結果的error Bar值很小，說明Incucyte^? 群體定量的重復性很好。后兩篇文章還用賽多利斯的另一款產品Octet^? 非標記分子互作系統(tǒng)檢測設計的生物藥物和靶點的親和力。

Incucyte^? 有什么優(yōu)點呢？

• 培養(yǎng)箱內自動進行長達數(shù)周的連續(xù)觀察，周末節(jié)假日也在采集數(shù)據，減少人力，提高實驗效率
• 組間樣本連續(xù)成像時樣品板不動，不影響效應細胞與靶細胞的相互作用，聚焦穩(wěn)定，結果更客觀
• 多個板位可分別獨立設置檢測程序，兼容各種多孔板和培養(yǎng)皿，通量高
• 具有劃痕、腫瘤球、類器官，趨化、血管生成等多個軟件模塊，提高分析效率
• 向導式軟件設置，簡化成像、數(shù)據分析和圖片、視頻導出流程，是真正可以用起來的設備
• 大于60種優(yōu)化過的詳盡的Protocol，提高實驗效率
• 用戶群廣，應用文獻數(shù)大于18,000篇，認可度高

只要放好您的細胞，其他交給Incucyte^?吧！跟隨諾貝爾獎獲得者的腳步用Incucyte?發(fā)好文章吧！

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-參考文獻-

【1】Gray, M.A., Stanczak, M.A., Mantuano, N.R. et al. Targeted glycan degradation potentiates the anticancer immune response in vivo. Nat Chem Bol 16, 1376–1384 (2020)

【2】Wang C, Hou Y, Zak J, Zheng Q, McCord KA, Wu M, Zhang D, Chung S, Shi Y, Ye J, Zhao Y, Hajjar S, Wilson IA, Paulson JC, Teijaro JR, Zhou X, Sharpless KB, Macauley MS, Wu P. Reshaping the tumor microenvironment by degrading glycoimmune checkpoints Siglec-7 and -9. bioRxiv [Preprint]. 2024 Oct 12:2024.10.11.617879. doi: 10.1101/2024.10.11.617879. PMID: 39416090; PMCID: PMC11483058.